神经源性膀胱M2受体mRNA的变化

时间 : 2009-11-29 18:43:33 来源：www.studa.net

[摘要]

神经源性膀胱M2受体mRNA的变化,医学论文,医药学论文

1.2.3标本采集和处理完成上述步骤后,氯胺酮肌肉注射,行下腹正中切口,暴露膀胱,每组每只犬切取膀胱体部约1cm×1cm组织,放入DEPC水处理过的冻存管,立即放入液氮罐保存运输。

1.2.4组织总mRNA提取标本逼尿肌肉组织匀浆后,参照RNAisoReagent说明书提取总RNA。

1.2.5RTPCRRTPCRcDNA第一链合成各样品RNA取5μL,加入olig（dT）primer1μL,DEPC水补足至12μL。混匀后低速离心,70℃孵育5min,冰浴1min,转入体系中依次加入5×ReactionBuffer4μL,Ribonucleaseinhibitor1μL,10mmon/LNTPmix2μL。混匀后低速离心,37℃孵育5min,加入逆转录酶1μL,42℃孵育60min,70℃孵育10min,冰上冷却1min,-20℃保存。同时还做一管对照RNA的逆转录,步骤剂量同上。

PCR反应体系模板2μL,引物（上游）0.5μL,引物（下游）0.5μL,10×Buffer2.5μL,ExTaq酶0.2μL,无菌双蒸水18.8μL,以消毒双蒸水补足25μL。条件:94℃5min→94℃40s→60℃40s→72℃40s,共35个循环;72℃10min。PCR产物10μL于1.5％琼脂糖凝胶电泳,紫外光凝胶成像并测定其灰度值,与相应的内参照GAPDH比值表示为最终结果。

1.3统计学处理数据以x±s表示,采用SPSS13.0统计软件进行多个独立样本非参数检验,3组间的两两比较使用2组间的非参数检验,检验水准取α=0.05。

2.1神经源性膀胱模型尿动力学检查见表1。膀胱尿道造影见图1。

2.2M2受体mRNA结果见图2。3组M2受体mRNARTPCR凝胶灰度比值分别为对照组（1.31±0.08）,骶上组（1.61±0.05）,骶下组（1.42±0.06）,（P<0.05）。表1神经源性膀胱模型尿动力学检查结果

3.1动物模型的构建神经源性膀胱动物模型多种,有糖尿病性、脊髓损伤性神经源性膀胱等。脊髓横断是制作神经源性膀胱的基本方法,可以采用多个部位,若横断脊髓平面过高,动物常因呼吸衰竭和植物神经反射亢进而死亡。犬的脊髓圆锥细而长,从第3腰椎平面一直延伸到第6腰椎平面,其中第1骶髓节段位于第5腰椎平面[2]。故本实验选取L4~5横断脊髓,保证了骶髓排尿中枢,也减少了

自主神经反射异常对膀胱功能的影响。脊髓损伤的动物模型可以选择使用大鼠、兔、猫、犬、猪、猴等。在制作神经源性膀胱模型中多数采用大鼠,一方面是大鼠生命周期相对短,另一方面饲养成本较低。但是犬神经根粗大,是神经刺激的重要动物模型;犬体积较大,易进行手术操作。另外,在动物脊髓损伤后,大动物（如猪、犬、猫等）大多较快形成反射性排尿,其脊髓休克期甚短,而小动物（如兔、大鼠）脊髓损伤后,常不能短期内形成反射性排尿,需人工协助排尿,每日3~4次,不协助排尿,动物常在数日内死亡[3]。

骶上型神经源性膀胱由于离断了膀胱排尿低级中枢与高级中枢的联系,膀胱的功能表现为反射性亢进,相当于上运动神经元损害表现。膀胱出现无抑制性收缩,膀胱容量减少,压力增大。而骶下型神经源性膀胱是膀胱失去了骶髓排尿中枢的支配,表现为尿潴留,膀胱容量增大,压力降低[4]。本研究选择犬观察尿流动力学关键指标,看到骶上型膀胱较骶下型容量减少,骶上型压力较骶下型增大;顺应性骶上型低于骶下型;膀胱造影证实膀胱容量的变化。这些变化主要是由膀胱收缩性改变所致,骶上型膀胱逼尿肌收缩性加强,骶下型膀胱逼尿肌收缩力减弱,而骶下型逼尿肌压力与对照组比较无统计学意义（P>0.05）,提示骶下型由于控制排尿的低级中枢受到破坏,形成高顺应性膀胱,在充盈期膀胱压力变化不显著。

3.2M2受体的变化M受体介导膀胱逼尿肌的收缩。根据分子生物学和药理学方法,M受体分为5个亚型（M1~M5）,在许多物种的膀胱逼尿肌中都已经得到证实,其中M2、M3受体占绝大多数[5],而且M2受体在数量上占绝对优势。在鼠的膀胱中,M2∶M3大约为9∶1,在猪和人膀胱中大约为3∶1。本研究对照组和实验组均可以表达M2受体的mRNA,证实犬膀胱逼尿肌中存在M2受体。通过测定M2受体的凝胶灰度值与内参GAPDH的灰度值,可以半定量比较M2受体,骶上型组较骶下型组和对照组都增加,而骶上型神经源性膀胱逼尿肌的收缩性在3组中最高,提示骶上型神经源性膀胱的逼尿肌收缩性的增加可能与M2受体上调有关。

M2受体在逼尿肌M受体中比例最多,但是它在正常膀胱组织中不能直接介导逼尿肌的收缩,一般认为M2受体是与Gi蛋白偶联,减少了cAMP的产生,逆转了β肾上腺素能介导的舒张,间接介导逼尿肌收缩[6]。但是Minoru等通过运用M3受体基因敲除小鼠的研究认为M2受体在膀胱收缩中可以发挥作用,但不是主要作用[7]。近来有研究认为,M2受体在病理状态膀胱（如神经源性膀胱、糖尿病性膀胱、流出道梗阻膀胱等）中与正常膀胱的作用机制有所不同。Pontari进行人神经源性膀胱逼尿肌条的体外实验,根据逼尿肌条的不同拮抗剂的药理亲和力,认为在人的神经源性膀胱中,M2受体直接介导了膀胱逼尿肌的收缩[8]。Tong研究病理性糖尿病大鼠模型,发现糖尿病膀胱逼尿肌中M2mAChR的mRNA和蛋白生物合成增加,认为M2mAChR的上调可以减弱交感的舒张效应,导致了逼尿肌的不稳定[9]。本实验中,膀胱收缩力增强的骶上型神经源性膀胱逼尿肌M2受体mRNA表达量增加,提示M2受体mRNA上调,说明M2受体可能直接参与介导了犬神经源性膀胱中逼尿肌的直接收缩。Ruggieri通过去神经膀胱和流出道梗阻膀胱的研究发现M2受体上调,M2受体蛋白与mRNA增加有相关关系[10],这些均提示在病理性膀胱中逼尿肌的收缩机制与正常膀胱有所不同。

本研究提示，在收缩力增强的骶上型神经源性膀胱中,M2受体可能直接介导了膀胱逼尿肌的收缩,进一步研究将有助于神经源性膀胱和不稳定膀胱的药物特异性治疗。

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