医学论文,体内和体外实验观察骨形成蛋白在骨肉瘤中的作用

体内和体外实验观察骨形成蛋白在骨肉瘤中的作用

口腔颌面外科杂志2000年第3期第10卷基础研究

作者：岳文　杨连甲　马明　董绍忠

单位：岳文（第四军医大学口腔医学院病理科710032）；杨连甲（第四军医大学口腔医学院病理科710032）；马明（第四军医大学口腔医学院病理科710032）；董绍忠（第四军医大学口腔医学院病理科710032）

　　关键词：骨肉瘤；骨形成蛋白；增殖细胞核抗原

　　摘　要：目的　研究骨形成蛋白（bonemorphogeneticprotein，BMP）在骨肉瘤中的表达及其与肿瘤增殖活性的关系，并观察BMP单抗体外对骨肉瘤细胞作用，为骨肉瘤的单抗治疗打下基础。方法　应用BMP单抗和免疫组化方法检测骨肉瘤中BMP蛋白的表达；并应用增殖细胞核抗原（proliferatingcellnuclearantigen，PCNA）的单抗对骨肉瘤的增殖活性进行检测；体外实验观察BMP单抗对骨肉瘤细胞OS-732的作用。结果　24例标本中有18例有BMP蛋白的表达；有BMP表达的骨肉瘤有较高的增殖活性；应用BMP单抗体外可以对骨肉瘤细胞系OS-732细胞产生生长抑制。结论　BMP有可能在肿瘤的发生和发展过程中起一定作用，可以作为估计骨肉瘤预后的参考指标，BMP单抗对骨肉瘤细胞的抑制作用为其临床应用于骨肉瘤的单抗治疗打下基础。

　　中图分类号：R739.8　文献标识码：A　文章编号：1005-4979（2000）03-0222-03

INVIVOANDINVITROSTUDYOFTHEEFFECTOFBMPONOSTEOSARCOMA

YUEWen，YANGLian-jia，MAMing，etal.

　　（DepartmentalofOralPathology，StomatologicalCollege，FourthMilitaryMedicalUniversity）

　　Abstract：Objective　Tostudytherelationshipbetweenbonemorphogeneticprotein（BMP）expressionandproliferatingactivityofosteosarcomaanddetecttheeffectofBMPantibodyonosteosarcomacell.Methods　BMPandproliferatingnuclearprotein（PCNA）expressionwereexaminedin24specimensofosteosarcomawithimmuno-histochemistrytechnique.TheeffectofBMPantibodyonosteosarcomacelllineOS-732wasstudiedinvitro.Results　BMPpositivereactionwasobservedin18/24specimens，thespecimenswithBMPhadmorepositivePCNA.InvitroBMPantibodycouldinhibittheproliferatingofosteosarcomacell.Conclusion　BMPmayplaysomerolesinthedevelopmentofosteosarcomaandmaybehelpfulmarkerstodeterminetheprognosisofosteosarcomaandtheremaybefeasibilitytotreatosteosarcomawithBMPantibody.

　　Keywords：Osteosarcoma;Bonemorphogeneticproteins（BMPs）;PCNA（proliferatingnuclearcellantigen）

　　骨肉瘤恶性程度高，极易发生转移，现在的治疗方法主要是手术治疗和化疗，术后5年生存率仅为20%左右。目前尚无较好指标判断骨肉瘤的生物学特征及其预后。骨形成蛋白（bonemorphogeneticprotein，BMP）最早由冻干骨肉瘤组织中提取，因其可以在体内诱导异位骨的形成而得名。BMP在骨肉瘤中有较为丰富的表达并影响肿瘤的生物学特征。本实验利用BMP的单克隆抗体检测骨肉瘤中BMP蛋白的表达，观察BMP和骨肉瘤细胞增殖活性间的关系以明确BMP在肿瘤中的作用，为BMP单抗应用于骨肉瘤治疗的研究打下基础。

　　1　材料和方法

　　1.1　标本来源

　　所有标本来源于第四军医大学口腔医学院手术切除并经病理诊断证实为骨肉瘤的标本（1996～1997年）。标本总例数为24例，患者平均年龄26.5岁。标本中性福尔马林固定，石蜡包埋，连续组织切片，厚度5μm。

　　1.2　免疫组化

　　BMP单抗（BMP-McAb）为本教研室制备，工作浓度为1∶50。增殖细胞核抗原（proliferatingcellnuclearantigen，PCNA）的单克隆抗体为PC10，购至DAKO公司，工作浓度为1∶50。ABC试剂盒购至Vector公司。常规免疫组化方法染色，DAB显色，设已知有BMP和PCNA表达的软骨肉瘤标本为阳性对照，以PBS代替一抗作阴性对照。BMP的阳性反应为细胞浆或骨基质的棕黄色着色，PCNA的阳性反应为细胞核的棕黄色着色。BMP和PCNA反应的阳性判断标准为高倍镜（×40）中有10个以上的阳性细胞。PCNA的阳性反应分级参照文献［1］。

　　1.3　BMP-McAb对骨肉瘤细胞的体外作用

　　人成骨肉瘤细胞OS-732由北京积水潭医院提供，经免疫组化鉴定有BMP的表达。选用不同浓度的BMP-McAb作用于OS-732细胞，以PBS代替一抗作阴性对照，采用噻唑兰活细胞染色法检测BMP-McAb的细胞毒作用，根据所测A490nmOD值计算BMP-McAb对细胞的杀伤率，公式如下：

　　1.4　检验方法

　　χ2检验，t检验

　　2　结　果

　　2.1　免疫组化检测结果

图1　骨肉瘤胞浆BMP表达阳性免疫组化（×400）

　　2.2　BMP表达与PCNA反应间的关系

　　PCNA的阳性反应为胞核的棕黄色着色（图2）。骨肉瘤的表达与PCNA的表达如表1。经校正χ2检验，P＜0.05，差异具有显著性，可以认为有BMP表达者有较高的PCNA反应。

　　2.3　BMP-McAb对OS-723细胞的作用

图3　BMP-McAb浓度和杀伤率间的关系表1　BMP表达与PCNA反应间的关系BMP例数PCNA表达

表2　BMP-McAb细胞毒实验结果

　　3　讨　论

　　BMP家族为一组形态和功能相近的多肽，1973年Amitani在冻干骨肉瘤组织中发现了BMP的存在。BMP的基本作用在于可以诱导未分化的间充质细胞分化为成骨细胞。随着分子生物学的进展，对BMP研究日益深入和扩展［2］，发现BMP在胚胎生长发育、创伤愈合和机体肿瘤等过程中起着非常重要的作用［3，4］。BMP在许多机体肿瘤中有表达，并与肿瘤的生物学特性相关［5，6］。BMP在骨肉瘤中有较多表达，并且明显影响骨肉瘤的生物学行为和预后，有BMP表达的骨肉瘤术前化疗效果不佳，术后容易发生远处转移，并且5年生存率明显低于BMP表达阴性组［7］。

　　实验中24例颌骨骨肉瘤中18例检测到BMP的表达，BMP在骨肉瘤中的广泛存在提示它们有可能参与肿瘤的发生和发展过程。BMP究竟为何会引起肿瘤的预后不良，肿瘤细胞所分泌的BMP是否在其诱骨活性外还有其它作用，目前尚无结论。为探讨此问题，实验对骨肉瘤的增殖活性作出检测。PCNA是近年发现的细胞增殖状态的标记物，为DNA聚合酶δ的辅助蛋白，主要表达于细胞G期和S期，可以准确反映细胞的增殖状况，目前已被广泛应用于肿瘤和非肿瘤组织增殖活性的研究。利用PCNA的单抗检测骨肉瘤细胞的增殖活性并对其表达与BMP表达的相关性作一分析，结果显示有BMP表达的病例有较高的PCNA表达。这提示BMP有可能通过某种机制促进肿瘤细胞的增殖活性，从而使肿瘤的恶性程度增高，造成肿瘤预后不良。为进一步明确BMP对骨肉瘤细胞的作用，实验还观察了BMP单抗对骨肉瘤细胞OS-732的体外作用，结果显示BMP单抗体外对骨肉瘤细胞的生长有明显的抑制作用，从另外一方面证实了BMP的存在与骨肉瘤的恶性增殖密切相关。

　　体内和体外实验表明，BMP的存在与骨肉瘤的恶性增殖密切相关，BMP单抗可以有效的抑制肿瘤细胞的生长。这提示临床上可以应用BMP单抗进行骨肉瘤的单抗治疗。将BMP的单抗应用于患者的病变区，单抗可以特异地与BMP结合，分布于肿瘤病变区及转移灶，可以对肿瘤的某些生物学特性进行抑制。目前BMP基因工程抗体方面的研究取得了很大进展，基因工程抗体去掉抗体的Fc段，解决了BMP抗体存在一定的抗原性会引起机体免疫反应的问题［8］，为骨肉瘤应用BMP单抗治疗的研究和应用开辟了广阔前景。

　　总而言之，BMP在颌骨骨肉瘤的发生和发展起一定作用，通过某种机制促进肿瘤细胞的增殖活性，从而影响了肿瘤的生物学特性，引起肿瘤的预后不良；应用BMP单抗可以对骨肉瘤细胞起抑制作用。结果一方面提示BMP的表达可以作为判断辅助骨肉瘤预后的生物学指标，另一方面为骨肉瘤的单抗治疗提供了理论基础。

　　作者简介：岳　文，女（1970-），山东济宁人，博士后.

　　参考文献：

　　［1］　岳文，龙彦，凌涤生等.口腔粘膜上皮癌前及癌变中PCNA和P53的表达［J］.实用口腔医学杂志，1998；14：19.

　　［2］　KesslerE，TakaharaK，BiniaminovL，etal.Bonemorphogeneticprotein-1:thetype1procollagenC-proteinase［J］.Science，1996;271（5247）:360.

　　［3］　IlinoJ，TakaoM，TakeshitaN，etal.cDNAcloningandgenomicstructureofhumanbonemorphogeneticprotein-3B（BMP-3b）［J］.BiochemBiophysResCommun，1996;223（2）:3045.

　　［4］　司晓辉，金岩，杨连甲.人重组骨形成蛋白2和转化生长因子β复合促进骨折愈合［J］.实用口腔医学杂志,1997；3：166.

　　［5］　HatakeyamaS，GaoYH，OharaNemotoY，etal.Expressionofbonemorphogeneticproteinsofhumanneoplasticepithelialcells［J］.BiochemMolBiolInt，1997;42（3）:497.