医学论文,足叶乙甙与8

足叶乙甙与8-甲氧基补骨脂素对人粘液表皮样癌高转移细胞株抑制作用

华西口腔医学杂志1999年第4期第17卷基础研究

作者：李焰　吴军正　司徒镇强　刘斌　韩建勋

单位：710032　第四军医大学口腔医学院口腔生物学教研室

　　关键词：粘液表皮样癌；肿瘤转移；足叶乙甙；8-甲氧基补骨脂素

　　摘要　目的:观察足叶乙甙（VP16）与8-甲氧基补骨脂素（8-MOP）联合用药对人粘液表皮样癌高转移细胞株（Mc3）的抑制作用。方法:采用MTT法及克隆形成法观察VP16与8-MOP联合用药对粘液表皮样癌的抑制作用。结果:Mc3细胞对VP16有较高的敏感性,且呈显著的剂量依赖性,其IC50值为1625.67ng/ml;小剂量的8-MOP可刺激Mc3细胞增殖,高浓度的8-MOP则明显抑制Mc3细胞生长,其IC50为75500ng/ml;VP16与8-MOP联合应用时,采用分别低于VP16IC50的100、320和1000ng/ml药物浓度,联合用药的合并指数（CI）均小于0.95,分别为0.350、0.599和0.880;VP16对Mc3细胞的生长及克隆形成有明显的抑制作用,IC50为126ng/ml。结论:8-MOP与抗癌药物VP16联合应用,显示明显协同抑制效应,VP16对Mc3细胞克隆形成有抑制作用。

InhibitoryEffectsofEtoposideCombinedwith8-methoxypsoralenonHighlyMetastaticHumanMucoepidermoidCarcinomaCells

LiYan,WuJunzheng,SituZhenqiang,etal

　　DepartmentofOralBiology,StomatologicalCollege,theFourthMilitaryUniversity

　　Objective：TostudytheinhibitoryeffectsofEtoposide（VP16）combinedwith8-methoxypsoralen（8-MOP）onhumanhighlymetastaticmucoepidermoidcarcinomacells（Mc3）.Methods:Mc3cellswereexposedtothedrugsandtheircombinationsatvariousconcentrations.Theinhibitoryeffectsweretestedwithmicroculturetetrazoliumcolorimetricassay（MTTassay）andcologenicassay.Results:TheIC50valuesofVP16and8-MOPwere1625.25ng/mland750000ng/mlrespectivily,theCI50ofthecombinationat100320and1000ng/mlofVP16with8-MOPwere0.350,0.599and0.880respectively.Conclusion:ThedataindicatethatcombinationofVP16and8-MOPissynergicintheinhibitionofMc3cellgrowth.

　　Keywords:　mucoepidermoidcarcinoma　neoplasmmetastasis　etoposide　8-methoxypsoralen

　　粘液表皮样癌是常见的涎腺恶性肿瘤,低分化的涎腺粘液表皮样癌侵袭和转移力强,常发生淋巴系统或远隔脏器转移,目前尚缺乏有效的化疗药物,其原因主要是它对传统化疗药物不敏感［1］。足叶乙甙（VP16）是一种抗肿瘤植物药,据报道［2］,VP16在体外对肿瘤细胞有明显的细胞毒作用,有显著的抗瘤活性,动物实验表明VP16对小鼠Lewis肺癌的肺转移有抑制作用,使转移灶减少。8-甲氧基补骨脂素（8-MOP）为中药补骨脂的有效成份之一。近年来,第四军医大学口腔医学院口腔生物学教研室有关研究证明,8-MOP对人粘液表皮样癌高转移细胞株（Mc3）有抑制作用。本文观察VP16对Mc3的抑制作用,检测VP16对口腔肿瘤的抗癌活性,同时选择不同剂量的VP16与8-MOP联合应用,旨在观察两种药物联合应用时对Mc3细胞的抑制作用,为临床化疗合理选择理想的抗肿瘤药物,进一步治疗粘液表皮样癌及肿瘤转移等提供实验依据。

　　1　材料和方法

　　1.1　材料

　　人粘液表皮样癌细胞系MEC-1由第四军医大学口腔医学院口腔生物学教研室建立,其高转移细胞株克隆的筛选及其生物学特性见参考文献［3］。细胞常规培养于含10%胎牛血清的RPMI1640培养液中,5%CO2,37℃,饱和湿度。VP16（大连制药厂生产）,8-MOP（天津药物研究所生产）,采用灭菌溶液配制成高浓度贮存液,使用前用培养液稀释至所需浓度。

　　1.2　细胞生长曲线测定

　　细胞计数法:细胞常规消化,配制成单细胞悬液,按照1.0×104/ml浓度接种于24孔培养板,5%CO2,37℃培养8d,每天取1组（3个平行孔）细胞,消化后计数。实验重复3次,取均数绘制细胞生长曲线,同时计算对数生长期的细胞倍增时间。

　　1.3　细胞数与光吸收值的关系

　　配制不同密度的细胞悬液,其细胞数为1.0×103～3.2×105/ml,分别接种于96孔培养板,每一浓度设3个平行孔,常规培养24h,采用MTT法测定每孔光吸收值（OD）。

　　1.4　MTT法药物敏感性测定

　　取对数生长期细胞,常规消化,接种于96孔培养板,1.0×103/孔,24h后,细胞贴壁,加入6个不同浓度梯度的药液,每一浓度设5个平行孔,VP16剂量为10～3200ng/ml;对照孔不加药,设12个平行孔。常规培养,药物作用5d后,按常规MTT比色法测定OD值,实验重复3次,取平均值绘制药物浓度依赖曲线并计算药物的半抑制浓度（IC50值）,并根据临床最大用药量（D）药物在血浆中浓度理论值（PPC）［4］计算药物的相对抗肿瘤活性（RAA）［5］。

　　1.5　联合用药

　　接种细胞于96孔板,选用VP16及8-MOP各4个浓度联合应用药物接触方案,5d后以MTT法测定OD值,实验重复3次。取均数绘制联合用药剂量-效应曲线,计算IC50值及50%抑制时联合用药的合并指数（CI50）［6］。

　　判断标准:CI50＜0.95为协同效应;CI50＞1.05为拮抗效应;CI50介于0.96～1.04之间为相加效应。

　　1.6　克隆形成法测定VP16对Mc3的抑制作用

　　采用双层琼脂培养法,铺设含20%胎牛血清的RPMI1640的底层培养基于24孔培养板,琼脂的浓度为0.5%;上层培养基琼脂浓度为0.3%,同时含有4个不同浓度梯度的药液及500/孔的细胞悬液,每组设4个平行孔,对照组不加药。常规培养2周,以每个集落细胞数等于或多于50个细胞为一个克隆,计数,实验重复2次,取均数计算克隆形成率,作图法计算VP16对Mc3克隆形成的半抑制浓度（IC50）。

　　2　结　　果

　　2.1　细胞数与OD值的关系

　　OD值随着细胞数增加而升高,采用SigmaPlot4.1软件分析细胞数量与MTT还原产物光吸收值的关系,结果（图1）所示,接种细胞数量在1.0×103～3.2×105/ml范围内与OD值呈显著正相关,相关系数r=0.96,表明MTT实验适用于该细胞株药物敏感性实验。

图1　细胞数与对应的OD值

　　2.2　细胞生长曲线

　　细胞倍增时间为26.4h,Mc3细胞生长稳定（图2）。

图2　细胞生长曲线

　　2.3　药物敏感性实验MTT法测定