枸杞子提取液对RCS大鼠视网膜色素变性的保护作用

作者：倪同上，刘相和，迟焕芳作者单位：青岛大学医学院人体解剖学教研室,山东青岛266021

【摘要】目的观察枸杞子提取液（LBA）对RCS大鼠视网膜色素变性的治疗作用。方法RCS大鼠24只，随机分为给药组和对照组，各12只。给药组大鼠出生后10d开始喂食LBA（1mg/kg）,对照组大鼠喂食等量生理盐水。两组大鼠分别于生后25、35、45d处死，取出眼球，制备组织切片，苏木精-伊红染色和TUNEL法检测视网膜感光细胞的数量。结果与对照组比较，给药组大鼠出生25d时感光细胞数目增多，TUNEL阳性细胞数目减少，差异有统计学意义（t=3.12、3.41,P<0.05）。结论在RCS大鼠视网膜变性的早期应用LBA，可对早期变性的神经元发挥保护作用。

【关键词】视网膜；枸杞子；大鼠

THEPROTECTIONOFLBAONTHEHEREDITARYRETINALDYSTROPHYRCSRATSNITONG-SHANG,LIUXIANG-HE,CHIHUAN-FANG（DepartmentofAnatomy,QingdaoUniversityMedicalCollege,Qingdao266021,China）

［ABSTRACT］ObjectiveToobservethetherapeuticeffectofLBAonthehereditaryretinaldystrophyRCSrats.MethodsAtotalof24RCSratswereevenlydividedintotreatmentandcontrolgroupinrandom.Startingfrom10postnataldays,LBA1mg/kgwasfedoninthetreatmentgroupandsalineonthecontrol.PhotoreceptornecrosisandapoptosiswereassessedbyHEstainingandTUNELdetection.ResultsComparedwiththecontrol,at25postnataldays,thenumberofphotoreceptorwasmorethanthatofthecontrol（t=3.12,P<0.05）,thenumberofTUNELpositivecellsdecreased（t=3.41,P<0.05）.ConclusionEarlyuseofLBAisofprotectiveactiononearlystageofretinaldegeneration.

［KEYWORDS］Retina;FructusLycii;Rats

视网膜色素变性是眼科十分常见的一种致盲性疾病，目前全世界约有数百万病人，在我国其发病率呈逐年上升趋势。RCS大鼠是一种自发性蜕变的大鼠，视网膜色素上皮不能有效吞噬感光细胞外节脱落的膜盘，致使膜盘堆积，感光细胞变性［1，2］，为研究视网膜色素变性的经典动物模型。LAVAIL等［3,4］研究显示，RCS大鼠视网膜色素变性过程中感光细胞处于低氧状态，高浓度氧可延缓感光细胞的凋亡，而氧不足则加速感光细胞的凋亡。枸杞子是茄科植物宁夏枸杞（LyciumbarbarumL．）的成熟干燥果实，为常用中药，具有滋补肝肾、益精明目之功效［5］。有研究结果显示，枸杞子对青光眼的节细胞（RGCs）有神经保护作用［5］。然而，以往研究结果缺乏广泛的动物病理模型实验结果支持。本实验观察枸杞子提取液（LBA，香港大学惠赠）对RCS大鼠视网膜色素变性神经元的保护作用，为视网膜色素变性疾病的治疗提供实验和理论依据。

1材料和方法

1.1动物及分组

雄性RCS胎鼠24只，体质量50~60g，随机分为给药组和对照组,各12只。12h光照、12h黑暗循环条件下饲养，自由饮食、饮水。给药组大鼠出生后10d开始喂食LBA（1mg/kg）,对照组大鼠喂食等量生理盐水。

1.2标本制作

两组大鼠分别在生后25、35、45d，用水合氯醛（400mg/kg）腹腔麻醉后，取出眼球，冲洗后立即放入40g/L多聚甲醛溶液中固定6h，去眼前节及玻璃体，依次放入100g/L蔗糖溶液中2h，200g/L蔗糖溶液2h，300g/L蔗糖溶液中过夜。用OCT包埋剂填满眼球,沿眼球矢状面作连续冷冻切片，每个标本各取5张切片，厚度5μm。

1.3原位细胞凋亡检测

采用苏木精-伊红及TUNEL染色法。切片常规脱蜡、脱水后,0.01mol/LPBS冲洗。ProteinaseK（20mg/L,10mmol/LTris/HCl,pH7.4）37℃孵育30min,0.01mol/LPBS冲洗2min,冲洗3次。蒸馏水新鲜配制体积分数0.03H2O2室温浸泡10min，0.01mol/LPBS冲洗2min，冲洗3次。

新鲜配制体积分数0.001TritonX-100枸橼酸钠缓冲液，4℃浸泡5min，0.01mol/LPBS冲洗2min，冲洗3次。滴加TUNEL混合反应液，于37℃下，60min,0.01mol/LPBS冲洗2min，冲洗3次。在激光显微镜下观察，激发波长为450~500nm，观察波长为515~565nm。

1.4结果观察

苏木精-伊红染色：光学显微镜下，每张切片取4个视野，200倍视野下计数30μm长的外核层感光细胞的数目。TUNEL检测：TUNEL阳性表达细胞胞核呈绿色荧光，观察视网膜每100μm长的视野内阳性细胞数。

1.5统计学处理

结果用x±s表示，采用SPSS10.0软件进行数据处理，两样本均数比较采用t检验。

2.1苏木精-伊红染色

对照组RCS大鼠出生15d时，视网膜未发育成熟；25d时，感光细胞染色加深，其数目有所减少，外节形态不规则，内节明显变窄；35d时感光细胞数目与25d相比明显减少（t=4.56,P<0.05）；45d时，感光细胞数目与35d相比明显减少，视网膜色素上皮细胞排列紊乱，体积增大，外形不规则，内核层细胞、神经节细胞形态和数目基本正常。给药组大鼠出生25d时，感光细胞数目较对照组细胞多（t=3.12，P<0.05）；35d时，感光细胞数目较其25d时下降（t=3.52,P<0.05）；45d时感光细胞数目与对照组比较无明显差异（P>0.05）。见表1。

2.2TUNEL检测

与对照组比较，给药组大鼠25d时TUNEL检测阳性细胞数目减少，差异有统计学意义（t=3.41,P<0.05）。给药组大鼠不同时间比较，35d时阳性细胞核数目最多，差异有显著性（t=3.05~4.13，P<0.05）。见表2。

自1857年DANDER等首次报道视网膜色素变性以来，众多学者对其进行了广泛的研究。但该病一直没有有效的治疗方法。目前，对视网膜色素变性的治疗方法主要有：基因治疗、感光细胞移植和药物干预。前两种方法因目前尚难解决的一些技术问题使其应用受到很大限制，而药物干预则通过影表1两组RCS大鼠感光细胞数目比较表2两组RCS大鼠TUNEL检测阳性细胞数比较响视网膜色素变性形成过程中一些代谢变化显示了良好的应用前景。

目前，枸杞子的研究给RCS大鼠视网膜色素变性的治疗带来了很大的希望。2002年哈佛大学研究小组报道，玉米黄素（zeaxanthin，枸杞子的成分之一）在视网膜内的高含量具有预防视网膜细胞凋亡的作用，玉米黄素的保护作用只在视网膜发挥作用，与血液中的玉米黄素浓度没有直接关系［7］。香港大学2006年的研究结果显示，枸杞子对青光眼RGCs有神经保护作用，枸杞子可以显著减少RGCs的凋亡作用［8］。其实，枸杞子的眼科治疗作用在东方传统医药中一直受到重视［8］。近年的研究显示，核黄素和玉米黄素两种成分在光中毒模型和老年性黄斑变性模型中，对光感受器有保护作用，能显著减少RGCs的变性，这种作用可能是通过阻断一氧化氮引发的神经细胞凋亡作用实现的［9］。

本文结果显示，给药组RCS大鼠出生后25、35d时外核层感光细胞的数目比对照组多，差异有统计学意义，提示LBA在RCS大鼠感光细胞变性的早期对感光细胞有保护作用。由于RCS大鼠视网膜色素变性是Mertk基因突变引起的［10］，主要表现为RPE不能吞噬感光细胞外节脱落的膜盘，以致膜盘碎片积聚在视网膜下，阻碍了氧从脉络膜到视网膜的扩散，视网膜的低氧状态导致了感光细胞的变性。虽然本文苏木精-伊红染色结果提示LBA对RCS大鼠视网膜变性早期感光细胞有保护作用，但研究中还显示，RCS大鼠出生25d以后，LBA对感光细胞变性基本不起作用，这可能是由于RCS大鼠生后25d感光细胞发生凋亡，35d是感光细胞凋亡的高峰期。随着感光细胞的凋亡，外核层细胞数目减少，对氧的需求量减少，RCS大鼠很有可能随着外核层细胞数目的减少而摆脱低氧状态。

目前普遍认为，虽然视网膜色素变性具有多种致病基因参与，但发病的最终共同途径是感光细胞的凋亡。通过干预细胞凋亡过程，有可能缓解病程进展。CHONG等［11］在大鼠中动脉栓塞模型实验中，采用TUNEL检测法对凋亡神经元进行标记，发现全身注射LBA可大量减少脑缺血半影区阳性标记的凋亡神经元。本文TUNEL检测结果显示，给药组大鼠视网膜在25d时凋亡的细胞数比对照组减少，余时间段两者差异无显著意义。提示LBA对感光细胞早期凋亡可能有抑制作用。我们以前的研究结果显示，RCS大鼠感光细胞凋亡与Bcl-2蛋白表达有关［12］，这种保护作用可能与细胞凋亡有关，值得进一步深入研究。