一氧化氮在糖尿病肾病中的作用

关键词：糖尿病；高血压；肾脏病变；一氧化氮

摘要目的探讨糖尿病和高血压大鼠肾脏一氧化氮途径与DM肾病的关系。方法将自发性高血压大鼠制成链脲佐菌素DM模型。设WKY、SHR和SHR-DM三组。除形态学观察外，还测定各组大鼠肌酐清除率、24小时尿蛋白、血及肾组织NO含量、肾脏NO合成酶活性和NOSmRNA表达水平。结果SHR-DM组大鼠24小时尿蛋白定量20周时明显高于其余两组，Cr无明显改变。血NO水平升高，肾NO含量降低。肾脏结构型NOS活性下降，诱导型NOS活性或iNOS/NOS比值增加。肾小球NOSmRNA表达面积扩大，入球动脉及小叶间动脉NOS基因表达明显下降。肾小球系膜增生，有形成K-W结节或纤维蛋白帽的趋势，系膜区基质增多，基底膜增厚，肾小动脉壁厚腔窄。结论STZ-SHR-DM模型出现的24小时尿蛋白增加、肾小球系膜及肾小血管病变提示DM肾病的产生；肾脏NO系统异常与DM肾病有关。

>Roleofnitrioxideondiabetinephropathy

ZHENGXu，LOUJie，YANGWenying，etal.Dptofendorinology，Sino-JapaneseFriendshipHospital，Beijing100029

AbstatObjetiveTostudytherelationshipbetweennitrioxidepathwayanddiabetinephropathy.MethodsRatswererandomlydividedintoWKY，SHRandSHR-DMwhihweretreatedwith75mg/kgofstreptozotoinandmaintainedfor10and20weeksrespetively.RenalNOamount，NOsynthaseativityandNOSmRNAexpressionweremeasuredbesidesmorphologialobservation.ResultsGlomerularlesionsinSHR-DMgroupinvolvedmesangialellproliferationtrendofK-Wnodeandfibrinap，andaumulationofmesangialmatrixandthiknessofglomerularmembranebasement.Therewerestillwallthiknessandavitystritureinrenalresistantvasulature.InSHR-DMitexistedlowerrenalNOlevelandonstitutiveNOS

ativitythanWKYTheareaofNOSgeneexpressioninglomeruliexpandedConlusionthelesionsofglomeruliandrenalresistantvasulatureausedbySTZ-SHR-DMmodelonfirmdevelopmentofdiabetinephropathyinthisstudy.diabetinephropathyisassoiatedwithabnormalityofrenalNOpathway.

KeywordsDiabetesmellitusHypertensionNephropathyNitrioxide

一氧化氮对肾功能有着重要影响，如调节肾脏及肾小球血流动力学、肾素分泌、球管反馈效应以及排钠等［1］。NO由NO合成酶作用于L-精氨酸生成。已发现至少三种NOS异构酶，其中Ⅲ型为内皮源性NOS，属结构型NOS，需Ca2+激活；Ⅱ型为诱导型NOS，细胞因子等可使其激活［2，3］。

糖尿病及高血压时有NO合成或代谢

障碍［4，5］。由于NOS分布于肾小球和肾血管［2，3］，故NO途径异常可能与肾小球和肾血管病变有关［1］。我们从肾脏NO含量、NOS活性及NOS基因表达等方面说明NO系统与DM肾病的关系。选择自发性高血压大鼠复制DM模型，目的在于尽快产生DM肾病。

一、实验动物

WKY和SHR大鼠42只由北京阜外医院提供。设WKY大鼠为正常对照，并将SHR大鼠随机分为SHR及SHR-DM两组。链脲佐菌素-SHR-DM模型制备：将STZ溶于0.1mol/L枸橼酸缓冲液中，注入SHR-DM组大鼠腹腔内24小时后该组大鼠血糖开始升高，以48小时后血糖≥13.9mmol/L为该模型成功，否则重复给药一次，经三次注射血糖仍未达上述要求者弃之。观察期间未用胰岛素。WKY及SHR组大鼠注入等量构椽酸缓冲液。

将大鼠用苯巴比妥钠，心内取血用于血清相关指标检测，取左肾速置液氮内，用作NOS活性等测定，右肾一半经脱水固定后用作原位杂交和光镜检查，另小块置质量分数为2.5%戊二醛内用于电镜观察。

1.用RBP-1大鼠尾血压测量仪测定大鼠尾动脉压。用葡萄糖氧化酶法测血糖。采用代谢笼收集各组大鼠24小时尿量以测定肌酐清除率及24小时尿蛋白定量。

2.血NO测定：用硝酸盐还原酶法［7］。所用试剂有：0.1mol/L磷酸盐缓冲液，3mmol/L还原型辅酶Ⅱ，500U/L硝酸盐还原酶［nitrateredutase，NADPH依靠型，真菌提取，sigma，USA］，0.8mmol/L黄素腺嘌呤二核苷酸，50mmol/LEDTA，1mmol/L硝酸钾标准储存液，用前稀释成50μmol/L的标准应用液。

3.肾脏NO和NOS活性测定：将肾组织块称重、剪碎，按50mg组织1ml加入含质量分数为1%牛血清白蛋白的Krebs液，在37℃恒温振荡水浴上，以分别为95%O2-5%CO2持续平衡孵育90分钟，取孵育液0.1ml，按Greiss法测定NO终末产物NO2含量，换算为肾组织释放的NO量。余下肾组织按文献［8］测定NOS活性：制备匀浆提取液，分别与含Ca2+的钙调蛋白或含EDTA的孵育液孵育，测定将3H-L-精氨酸转换为3H-L-胍氨酸的量，分别表示LNOS和iNOS活性，二者之差为NOS活性，以pmolmg-1pr-1min-1表示，蛋白定量用考马斯亮兰比色法。

4.NOSmRNA原位杂交：将肾组织块梯度乙醇脱水、石腊包埋、切片。组织玻片脱腊脱水，0.3%H2O2封闭，蛋白酶K消化，4%多聚甲醛后固定，乙醇脱水、风干。将加热后的杂交液（含生物素标记的NOS-RNA探针，北京医科

大学病理教研室合成）加于玻片上杂交，42℃孵育16～20小时，2×SSC甲酰胺及2×SSC溶液各洗涤20分钟。1%马血清封闭，滴加1∶100稀释的ABC复合物并室温孵育1小时。DAB显色，苏木素复染。去离子甲酰胺、硅精DNA、二巯基糖醇及50%硫酸右旋糖酐均购自美国Gibo公司。以细胞胞浆内棕色颗粒为阳性，并依杂交信号强弱分为0、Ⅰ、Ⅱ及Ⅲ级，分记0、2、4、6分。

5.肾脏组织学：将肾组织块脱水、石腊包埋、切片，HE和PAS双重染色，观察光镜下肾脏形态学改变。将肾小球系膜增生分成0～Ⅲ级，分记0、2、4、6分。0级：正常肾小球；Ⅰ级：系膜增生宽度小于毛细血管直径，呈节段性分布；Ⅱ级：系膜增生宽度大于毛细血管直径，呈弥漫性分布；Ⅲ级：系膜增生宽度呈团块状聚集，弥漫指状分布，挤压血管腔。动脉病变分为0、Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ级，分记0、2、4、6分，玻璃样变记2分。每例随机取10个肾小球及5个同类型动脉，按上述标准记分取均数。

6.电镜观察：取肾皮质常规固定、脱水、包埋，RKB-Ⅴ型切片机切片，HE染色，光镜肾小球定位后超薄切片，醋酸铀染色30分钟，枸椽酸铅染色5分钟，日本电子1200透射电镜观察肾小球系膜区基质及基底膜，真彩色计算机图像分析系统进行图像分析处理。

三、统计学处理

实验结果以表示，n≥5。原位杂交及形态学观察均采

用半定量记分。多组资料用SYSTAT统计软件做方差分析，以P＜0.05为有显著性差异。

SHR和SHR-DM组血压显著高于WKY正常对照组，SHR-DM组血压低于SHR组。SHR-DM组血糖明显高于其余两组。Cr各组无显著差异。24小时尿蛋白定量10周时两病变组均增加，20周时SHR-DM组明显高于WKY及SHR组。

表1血压、血糖及肾NO测定

组别血压血糖肾NO血ONUTPCr10周WKY117.1±13.27.36±1.24588.5±69.428.8±6.54.7±4.931.3±13.0SHR184.4±17.19.70±2.08211.6±62.017.6±3.517.2±5.1△25.9±8.2SHR-DM163.9±14.5△#20.83±2.47289.5±90.5△39.2±29.5△☆14.5±5.3△20.8±5.920周SKY102.5±9.48.86±1.79555.3±30.937.0±6.04.0±1.735.9±17.1SHR209.2±24.810.22±3.27483.5±113.04.0±0.4△12.4±4.028.9±13.3SHR-DM162.0±18.6△☆30.50±3.55259.8±75.1△☆54.3±11.125.6±12.3△#26.9±12.0与WKY比，P＜0.05，△P＜0.01，P＜0.001；与SHR比，#P＜0.05，☆P＜0.01，P＜0.001光镜下，SHR-DM组皮质肾小球系膜轻度增生，系膜宽度小于毛细血管直径，呈节段性分布；近髓质肾小球系膜中～重度增生，系膜宽度大于毛细血管直径，呈弥漫性分布或团块状聚集或弥漫指状分布，挤压毛细血管腔，有形成K-W结节及纤维蛋白帽的趋势。纵观皮质和近髓质肾小球系膜病变，呈梯度逐渐加重趋势。入球动脉、小叶间动脉及弓状动脉均有不同程度的病变，尤以入球动脉最突出，小叶间动脉次之，可见管壁增厚、管腔狭窄及玻璃样变等改变。与之相比，SHR组肾小球病变较轻，皮质肾小球正常，近髓质肾

小球系膜增生程度较轻，且动脉病变也相对轻些。

表2光镜下肾脏病理改变

组别皮质肾小球近髓质肾小球入球动脉小叶间动脉弓状动脉10周WKY0.03±0.050.2±0.10.2±0.10.2±0.10.03±0.05SHR0.40±0.404.1±0.11.7±0.5△1.9±0.9△3.30±0.05SHR-DM2.50±0.90☆4.6±0.8☆□2.8±0.4☆2.6±0.8△2.70±1.20△20周WKY0.05±0.060.1±0.10.6±0.21.1±0.40.07±0.06SHR0.03±0.053.0±0.71.1±0.40.7±0.30.70±0.40SHR-DM3.20±0.60☆5.6±0.3☆2.4±0.7△☆4.0±1.4△☆2.00±0.70#

皮质与近髓质肾小球比，□P＜0.01，P＜0.001；余同表1电镜下，SHR-DM组肾小球系膜区扩大，基质较WKY和SHR组明显增多，GBM局灶性增厚。SHR组系膜区扩大及基质增多远不及SHR-DM组，且无GBM改变。

表3肾小球超微结构改变

组别系膜区面积系膜基质基底膜厚度10周WKY1230.7±345.7353.1±50.327.8±4.8SHR1365.4±325.459

8.2±129.732.2±3.6SHR-DM2377.9±565.5△☆1437.0±293.437.0±4.7△20周WKY1303.1±423.3348.2±53.331.3±3.1SHR2444.9±464.2△960.8±149.6△35.5±4.2SHR-DM3061.9±843.61867.9±538.8☆60.9±7.1符号意义同表1血NO水平在SHR-DM组显著升高，在SHR组则呈下降趋势。SHR-DM组肾脏NO水平明显低于WKY组，20周时还低于SHR组；肾脏tNOS活性下降，其中NOS活性明显降低，10周时iNOS活性升高，iNOS/NOS比值显著大于WKY及SHR两组。表4肾脏NOS活性测定组别tNOSNOS（pmol－mg-1

－pr-1.min-1）iNOSi/比值10周WKY26.7±2.614.2±2.312.6±1.90.9±0.2SHR19.1±2.6△7.4±2.2△12.5±1.41.8±0.6SHR-DM20.2±2.0△5.3±1.6△14.8±0.7#3.0±0.9☆20周WKY27.2±3.014.2±2.313.0±1.50.9±0.2SHR16.0±1.34.3±1.711.4±2.33.3±1.3SHR-DM16.2±1.42.1±1.014.0±1.4#7.8±3.2△☆

符号意义同表1NOSmRNA表达在SHR-DM组的特点：肾小球表达面积增加，入球动脉及20周时小叶间动脉NOS基因表达明显减弱，弓状动脉该基因表达无显著改变。SHR组入球动脉及小叶间动脉NOSmRNA表达减弱程度明显轻于SHR-DM组，余与SHR-DM组类似。

表5肾脏NOSmRNA表达

组别肾小球入球动脉小叶间动脉弓状动脉程度面积10周WKY4.0±1.83.3±1.03.9±1.44.3±1.03.4±1.0SHR4.5±0.94.3±0.81.7±0.9△2.6±0.8△2.6±0.7SHR-DM5.5±1.05.1±0.61.8±0.7△4.7±0.7☆3.0±0.920周WKY5.0±1.14.0±0.52.9±0.63.9±0.33.5±0.9SHR5.3±1.05.1±0.7△1.5±0.9△3.7±0.64.0±0.1SHR-DM5.6±1.75.1±0.30.4±0.5△#2.7±0.5△☆3.6±8.9

符号意义同表1

本实验SHR及SHR-DM组血压及后者血糖升高的结果说明，高血压及DM动物模型是成功的。SHR-DM组大鼠20周时24小时尿蛋白定量明显高于其余两组，皮质和近髓质肾小球系膜区扩大，系膜细胞增生并有形成K-W结节及纤维蛋白帽趋势，系膜区基质增多，GBM增厚，肾小动脉硬化等改变均提示STZ-SHR-DM肾病的产生，同时说明24小时尿蛋白定量较Cr观察DM肾病更敏感。

本研究SHR-DM组血压低于SHR组的现象主要与血NO水平有关，前者血NO水平明显升高，而后者血NO含量呈下降趋势。比较二者肾NO含量，10周无显著差异，20周时SHR-DM组低于SHR组，提示肾NO含量对血压影响不大，以局部作用为主，可能与肾脏病变有关。有关上述现象与血NO水平关系的解释：高血压时较大血管内皮受损，NO合成下降，血NO含量降低；DM主要损伤小血管，且其超氧化状态使NO代谢加速，大血管内皮合成NO代偿性增加，血NO

水平升高，结果高血压合并DM后血压较前降低了。

肾组织NO含量在某种程度上说明肾脏结构和功能。SHR-DM组肾NO含量持续降低且20周时显著低于SHR组的结果与其24小时尿蛋白定量及肾脏病变相符，提示肾脏NO合成障碍与DM肾病有一定关系。

tNOS由NOS和iNOS组成。SHR-DM组肾tNOS活性下降是NO减少的重要原因。我们还发现，tNOS的构成比例发生了变化，一方面NOS活性下降提示血管内皮功能障碍；另一方面iNOS活性或i/比值升高又与病理过程有关［9，10］。SHR组情况类似，但iNOS活性或i/比值增加幅度远不如SHR-DM值，说明高血压合并DM后肾脏损害加重了。

以往研究指出，eNOS主要分布在血管内皮，iNOS则于肾间质巨噬细胞、肾小球和血管平滑肌［9］。本文WKY大鼠NOSmRNA在肾小球及各级肾血管均有表达的事实再次提示正常大鼠肾脏有eNOS和iNOS的基础表达。

SHR-DM组肾小球NOSmRNA表达面积增加代表一种病理过程，它与肾小球系膜增生，系膜区增宽的病理改变相一致。本文iNOS活性及i/比值增加提示肾小球NOSmRNA为iNOSmRNA，且该基因表达与肾脏病理变化有关。SHR-DM组肾阻力血管NOSmRNA表达下调导致NOS活性降低及NO合成减少与肾阻力血管病变相应，提示DM时肾NO系统障碍与肾小血管病变有关。由于近髓质肾小血管较皮质丰富，故肾小血管内皮合成NO障碍时首先影响近髓质肾小球［11］，形成本文中所见的皮质和近髓质肾小球病变梯度。因SHR-DM组肾小血管病变重，NO合成障碍更突出，故该组较SHR组肾小球病变范围广，程度重。

综上所述，高血压合并DM肾病时，肾阻力血管NOSmRNA表达降低和NOS活性下降所致的NO合成障碍与肾阻力血管病变相关。肾小球NOSmRNA表达

面积扩大、iNOS活性或i/比值升高与肾小球病变有关。

本课题受国家人事部项目资助

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