时间 : 2016-04-08 11:07:33 来源:求医网
针对以上描述,专家为您解答如下:一、细胞学方法对皮损刮片做Wright-Gemsa (Tzanck试验)或Papanicolaou染色,可检出HSV感染特征的巨细胞包函体,但不能区别HSV感染或水痘-带状疱疹病
患者信息:
姓名:李先生
性别:男
年龄:28
患病信息:怀疑是患了生殖器疱疹但不知道是不是,请问患了此病应该如何诊断?
针对以上描述,专家为您解答如下:
一、细胞学方法
对皮损刮片做Wright-Gemsa(Tzanck试验)或Papanicolaou染色,可检出HSV感染特征的巨细胞包函体,但不能区别HSV感染或水痘-带状疱疹病毒感染,敏感性仅为病毒分离的60%。
二、培养法
从水疱底部取材做组织培养分离病毒,为目前较敏感、最特异的检查方法,需5-10天,因其技术条件要求高,价格昂贵,不能普遍使用。
三、抗体检测
目前最广泛的是HSV-2抗体检测,如蛋白印迹法也可用gD2作抗原检测HSV-2抗体,具有敏感性,且能区分HSV-1和HSV-2的优点。
四、基因诊断
(一)用PCR分型检测单纯疱疹病毒
PCR是一种敏感性高,特异性强的快速检测方法,标本中含有1fgHSV-DNA就可以检出,其在HSV感染的诊断研究中发展较快,且分型检测HSV是发展的趋势。
1、标本采集和处理
(1)标本采集
①脑脊液:直接无菌采取患者0.5ml脑脊液标本于无菌试管送检.如肉眼可见血色,应离心取上清。
②羊水及婴儿血清:同上,应避免溶血.
③脑组织:脑组织尸检、活检标本,加1mlPBS标本缓冲液研磨后,待检。
④眼及皮肤病灶分泌物:用预测(半干)棉拭子直接取患处分泌物,置1mlPBS标本缓冲液中送检。
⑤生殖器(宫颈、阴道、外阴、阴茎)标本:先用消毒棉拭子擦去病变部位表面粘液、污垢,再用预潮棉拭子用力擦拭患处分泌物,置1mlPBS标本缓冲液中送检。
(2)标本处理
①预处理:所有液体标本均可直接进行模板制备;可以取100μl标本液,离心5000r/minX5min后,去上清,取沉淀物进行模板制备。
②模板制备:
a:蛋白酶K消化裂解法:沉淀物加100μl蛋白酶K消化裂解液,55℃1h后,煮沸10min,离心5000r/minX5min,收集上清。
b:水煮法:沉淀物加100μl蒸馏水,摇均水煮20min,离心5000r/minX5min收集上清。
c:1%TritonX-100裂解法:取采集的标本液100μl,加入1μlTritonX-100,水煮20min,5000r/minX5min,收集上清。
d:5%NP-40裂解法:取采集的标本液100μl,加5μlNP-40,水煮20min,5000r/minX5min收集上清。e:如标本溶血严重经上述裂解处理后,再加等体积酚-氯仿抽提、冷乙醇沉淀DNA,加10μlDW溶解待检。
2、PCR扩增
(1)引物设计。以HSVDNA聚合酶的高保守区为检测靶序列以确保特异性。设计3个引物,一个上游共同性引物,DNAP5(5′ATGGTGAAAACATCGACATGTACGG3′):
二个下游特异性引物,DNAP3-1(5′CCTCGCGTTCGTCCTCGTCCTCC3′)和DNAP3-2(5′CCTCCTTGTCGAGGCCCCGAAAC3′),可以分别扩增出HSV-1469bpDNA片段(1981~2359)、HSV-2391bp片段(1561~1953):从二型PCR扩增产物中设计了一个不分型的特异性探针HSVP35‘GGCGTAGTAGGCGGGGATGTCGCG3‘)。
(2)PCR实验体系。取模板10μl:DNAP50.5(0.2μmol/L):DNAP3-10.5μl(0.2μmol/L):DNAP3-20.5μl(0.2μmol/L):4XdNTP8μl(4X200μmol/L):10XdNTP8μl(4X200μmol/L);10X缓冲液10μl:DMSO4μl;加DW65.5μl;石蜡油30μl.。
水煮(96℃~100℃)7min
加TaqDNA聚合酶1μl;(2.5U)
72℃4min↓
95℃40s↓,
65℃60s→72℃70s↓
33个循环
70℃4min
3.扩增产物的检测和分析
(1)琼脂糖凝胶电泳染色法:取扩增产物20μl加样品缓冲液4μl混匀后,点样于2%琼脂糖凝胶板,70V电泳15~20min,溴化乙锭(EB)染色5min,于紫外灯下观察结果在溴酚蓝后面有一条或二条亮红带为阳性结果,HSV-2带在前,HSV-1带在后,无带则为阴性结果。
(2)XhoI酶谱法:取HSV-1型PCR产物50μl加XhoI50U,37℃1h后,置3%琼脂糖凝胶中,70V电泳15~20min,可产生46bp片段带(引物后面);与正常PCR产物比较,XhoI酶切后的大片段电泳位置前移。
(3)Southern印迹法:PCR产物20μl经电泳分离后,用变性液处理60min,再用中和液处理90min,转移至硝酸纤维素膜上:80℃烤膜2h,42℃预杂交(杂交液中)30min,加入32p标记HSVP3探针后,42℃杂交过夜;次日用1%SDS/PBSpH7.2,42℃洗15min,0.5%SDS/PBSpH7.2,42℃洗15min;膜置X线暗盒内放射性自显影12~15h,显影为阳性,不显影为阴性。
(责任编辑:jbwq)
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