迪谢内/贝克肌营养不良症基因缺失的分布

时间 : 2015-12-30 10:55:54 来源：放心医苑网

[摘要]

内/贝克肌营养不良症基因缺失的分布中华神经科杂志1998年第4期第31卷*论著*作者：刘玉阁　戴志华　谢丙单位：300052天津医科大学总医院神经病学研究所　　关键词：肌营养不良症；dna印迹法；多重聚合酶链反应　　【摘要】　目的　分析迪谢

迪谢内/贝克肌营养不良症基因缺失的分布

中华神经科杂志1998年第4期第31卷*论著*

作者：刘玉阁戴志华谢丙

单位：300052天津医科大学总医院神经病学研究所

关键词：肌营养不良症；dna印迹法；多重聚合酶链反应

【摘要】目的分析迪谢内/贝克肌营养不良症(dmd/bdm)基因缺失类型及其分布规律。方法采用全长cdna探针和18对引物多重聚合酶链反应(mpcr)检测138例dmd/bmd。结果用全长cdna探针,dna印迹法检测出86例患者基因缺失和4例重复,缺失率为62.3%。用18对引物mpcr检测出82例缺失,占全长cdna探针检出缺失的95.4%。结论基因缺失的分布具有一定的规律性。86例缺失主要集中在两个缺失热区内,其中59例(68.6%)分布于外显子44～52,相当于cdna8和7的3′端4个外显子覆盖的区域内。23例缺失(26.7%)分布于5′端外显子1～19,相当于探针1～2a和2b～3的检测区域内。仅4例(4.7%)缺失分布于基因的中心区。基因缺失的类型及分布与表型有一定关系。

thedistributionofgenedeletionsinduchenne/beckermusculardystrophyliuyuge,daizhihua,xiebingdi.departmentofneurologicalresearchinstitute,tianjinmedicaluniversitygeneralhospital,tianjin,300052

【abstract】objectivetoanalysethelocationsandtypesofgenedeletionsinduchenne/beckermusculardystrophy(dmd/bmd).methods138patientsofdmd/bmdwerescreenedwiththecompletecdnaprobesandmultiplexpolymerasechainreaction(mpcr)amplificationof18pairsoligonucleotideprimers.results86deletionsand4duplicationsweredetected,thedeletionfrequencyis62.3%.82deletionsweredetectedwith18parisprimers,whichis95.4%ofdeletionsdetectedbycompletecdnaprobes.conclusions86deletionsofdystrophingenewereclusteredmainlyintwohigh-frequencydeletionregions,59cases(68.6%)locatedintheregionofexons44～52correspondingtotheareacoveredbythefourexonsin3′sideofcdna7andcdna8;23cases(26.7%)wereinexons1～19of5′sidecorrespondingtotheareacoveredbytheprobes1～2aand2b～3;4cases(4.7%)wereintheregioncoveredbyprobe4～5aincentralregionofthegene.thelocationsandtypesofdeletionindystrophingeneareassociatedwiththephenotypeofdmd/bmd.

【keywords】musculardystrophysouthernblottingmultiplexpolymerasechainreaction

由于dna重组技术的应用,迪谢内和贝克肌营养不良症(dmd/bmd)的基因诊断已精确到分子水平。目前致病基因已定位于x染色体短臂2区1带(xp21),基因长2300kb,含79个外显子,编码一个长14kb的mrna,基因蛋白产物是一种分子量为400kd,位于肌细胞膜上的骨架蛋白——抗肌营养不良蛋白(dystrophin)。dystrophin基因缺失或重复导致dmd或bmd。随着dmd全长cdna的克隆和7个亚克隆cdna探针的应用,已经能够检测出基因突变的50％～67%［1,2］。近年来,chamberlain等［3］和beggs等［4］分别选择两组不同的最易发生缺失的位点设计了18对寡核苷酸引物,建立了检测本病基因缺失的多重聚合酶链反应(mpcr)新体系,使dmd/bmd的基因诊断方法更简便和准确。我们参照chamberlain等和beggs等提供的引物序列合成18对引物,对我院经临床、肌电图、血清酶学和肌活检确诊的138例dmd/bmd患者采用dna印迹和mpcr两种方法进行筛查,并对我国dmd/bmd基因缺失的分布规律进行分析。

对象和方法

一、对象

138例dmd/bmd均为我院住院或门诊患者。临床表现为四肢近端对称性进行性加重的肌肉萎缩,gowers征阳性,80%伴有腓肠肌假肥大等。肌电图检查显示肌源性改变,血清肌酸磷酸激酶含量显著增高,肌活检均显示特征性病理改变。依据丧失行走能力的年龄将患者分为四组:(1)dmd(94例),13岁以前丧失行走能力;(2)中间严重型(8例),13～16岁丧失行走能力;(3)bmd(31例),16岁以后仍能行走;(4)5例10岁以下患儿归为一组（未分类）。30例正常对照均为非神经肌病的患者。

二、方法

1.dna印迹法:基因组dna按照kunkel等［5］的方法从外周血白细胞中提取,经hindⅲ(gibcobrl)内切酶消化后,用0.85%琼脂糖凝胶电泳,再转移到hybond-n尼龙膜上。7个亚克隆cdna探针(1～2a,2b～3,4～5a,5b～7,8,9,10～14)由kunkel赠送,探针用α-32p-dctp(3000ci/mmol,amersham)按照随机引物标记法进行标记(试剂盒由gibcobrl提供),按照amos等［6］的方法进行预杂交、杂交、洗膜,最后在-70℃行放射自显影。

2.mpcr:按照chamberlain等［3］和beggs等［4］提供的序列,由cybersyn生物工程公司合成18对引物,经寡核苷酸纯化柱(opc)纯化。将18对引物分为两组,分别对患者基因组dna进行pcr扩增。50μl反应体系含670mmoltris-hcl,166mmol(nh4)2so4,67mmolmgcl2,10mmolβ-巯基乙醇,10μg/μlbsa,250mmoldntp(promegausa),ph8.0,每对引物各0.25μmol,模板dna500ng。将反应液于97℃预变性10分钟,加入5utaqdna聚合酶(bm,德国),然后将反应液放入pcr热循环仪(perkin-elmer)中,按照94℃变性30秒,56℃复性30秒,70℃延伸2分钟,进行30次循环,最后在70℃延伸7分钟。取10μl扩增产物，用2%琼脂糖在0.5×tbe中电泳,在紫外灯下观查结果并摄影保留结果。

结果

138例dmd/bmd患者中检出基因缺失86例(62.3%),基因重复4例(2.9%)。基因缺失中dmd61例(70.9%),bmd18例(20.9%),中间型4例(4.7%),未分类3例(3.5%)。86例缺失中用cdna8检出47例(54.7%),1～2a探针检出19例(22.1%),2b～3探针检出16例(18.6%),4～5a探针检出11例(12.8%),5b～7探针检出33例(38.4%),cdna9探针检出11例(12.8%)。其中52例缺失用两个以上探针检出。用探针cdna8,1～2a和2b～3检出的缺失占全部缺失的91.4%。用探针10～14未检出缺失。pcr扩增结果与dna印迹法分析结果一致,其中用第一组引物检出68例缺失,占全长cdna探针检出缺失的79.1%,在未检出缺失的患者中用第二组引物检出14例缺失,占全长cdna探针检出缺失的16.3%。两组引物检出缺失的总和占全部缺失的95.4%。86例缺失集中分布在两个热点区,其中外显子1～19缺失23例(26.7%),44～52缺失59例(68.6%),基因中心区外显子20～42缺失仅4例(4.7%)。

讨论

随着dmd全长cdna的克隆和7个亚克隆cdna探针的应用,目前已经能够检测出dmd/bmd基因突变的67%［2］。虽然dna印迹法分析步骤繁琐,但这一技术可以检测出迄今发现的人类最长的基因——dmd基因的全部缺失和重复,所以dna印迹法仍然是一种比较完善的检测手段。使用这一技术用7个亚克隆探针即可覆盖基因的全部外显子,并且能够确定缺失两端的边界类型和判断缺失的类型。本组用全长cdna探针对138例dmd/bmd进行基因检测,检出86例缺失,缺失率为62.3%。其中dmd61例(70.9%),bmd18例(20.9%),中间型4例(4.7%),未分类3例(3.5%)。仅用探针cdna8,1～2a和2b～3即可检出全部缺失的91.4%。

在对大量dmd/bmd基因缺失分析的基础上,chamberlain等［3］和beggs等［4］分别以9个不同的缺失热点外显子旁侧序列设计了两组引物,并联合应用这两组引物检测出用全长cdna探针检出缺失的98%。mpcr省略了dna印迹法杂交过程中的许多繁琐步骤,在不使用同位素的条件下,把至少需要1周完成的工作缩短至1～2天。本组参照上述引物序列合成两组引物(第一组:外显子4,8,12,17,19,44,45,48,51;第二组：启动子,外显子3,6,13,43,47,50,52,60),分两步对138例dmd/bmd进行mpcr扩增,结果与dna印迹法分析结果一致。这一结果与文献报道的缺失检出率接近［4］。其中以外显子44,45,47,48,50,51和52缺失最多见。实践证明这两组引物完全适用于我国dmd/bmd患者的基因诊断。应该指出的是,由于这两组引物均未覆盖基因中心区域,4例相当于探针4～5a检测区域内的缺失漏检,漏检率为4.2%。本组用外显子60未检出缺失,可能与病例数较少有关。mpcr对基因缺失的诊断准确可靠,可以避免dna印迹法杂交过程中dna印迹转移不良或在杂交过程中出现气泡阻碍杂交而导致的诊断失误。

本组结果显示,dmd/bmd基因缺失的分布具有一定的规律性。86例缺失中59例(68.6%)分布于外显子44～52,相当于探针cdna8和7的3′端4个外显子覆盖的区域内。23例(36.7%)缺失分布于5′端外显子1～19,相当于探针1～2a和2b～3的覆盖区域内,其中2例缺失累及外显子1。仅4例(4.7%)缺失分布于基因的中心区相当探针4～5a的检测范围内。因此,本组基因缺失的热点区主要集中在基因中心区3′端外显子44～52和5′端外显子1～19。这一结果与koenig等［7］报道的dmd/bmd两个缺失热区相一致。近来对基因缺失热区内含子44、45、49和50的研究发现其中存在许多小的重复序列,这些重复序列是基因重组的热点［8,9］。因此,这一特点可能是本病缺失热区突变率较高的原因之一。

本病临床表型与基因缺失部位和缺失类型有一定关系。本组2例患者基因缺失累及外显子1～4,因缺少起动基因和翻译的起始位点,表型为dmd。52例为移码缺失,因缺失破坏了阅读框架而导致蛋白翻译的中止,临床表现为严重的dmd。25例为整码缺失,其中大部分缺失位于外显子6～42,由于缺失部位并非基因的关键部位,部分基因功能保留,表型多为症状较轻的bmd。分析结果表明，90.9%的缺失符合monaco等［10］提出的翻译阅读框架理论。约1/3的dmd/bmd系由点突变引起,用目前的常规检测方法均不能检出。近来一些学者报道,用以pcr为基础的异双显性组和分析检测点突变获得成功［11］,值得进一步探讨。

参考文献

1koenigm,hoffmanep,bertelsoncj,etal.completecloningoftheduchennemusculardystrophy(dmd)cdnaandpremilinarygenomicorganizationofthedmdgeneinnormalandaffectedindividuals.cell,1987,50:509-517.

2forrestsm,crossgs,flintt,etal.furtherstudiesofgenedeletionsthatcauseduchenneandbeckermusculardystrophies.genomics,1988,2:109-114.

3chamberlainjs,gibbsra,ranierje,etal.multiplexpcrforthediagnosisofduchennemusculardystrophy.newyork:academicpress,1990.272-281.

4beggsah,koenigm,boycefm,etal.detectionof98%ofdmd/bmdgenedeletionsbypolymerasechainreaction.humangenetics,1990,86:45-48.

5kunkellm,smithkd,boyersh,etal.analysisofhumany-chromosome-specificreiterateddnainchromosomevariants.procnatlacadsci,1977,74:1245-1249.

6amosja,flemingbc,gusellajf,etal.relativeargininosuccinatesynthetasemrnalevelsandgenecopynumberincanavine-resistantlymphoblasts.biochimbiophysacta,1984,782:247-253.

7koenigm,beggsah,moyerm,etal.themolecularbasisforduchenneversusbeckermusculardystrophy:correlationofseveritywithtypeofdeletion.amjhumgenet,1989,45:498-506.

8clemenspr,fenwickrc,chamberlainjs,etal.carrierdetectionandprenataldiagnosisinduchenneandbeckermusculardystrophyfamilies,usingdinnnucleotiderepeatpolymorphisms.amjhumgenet,1991,49:951-960.

9chakrabortyr,zhongy,andrademd,etal.linkagedisquilibriaamong(ca)npolymorphismsinthehumandystrophingeneandtheirimplicationsincarrierdetectionandprenataldiagnosisinduchenneandbeckermusculardystrophies.genomics,1994,21:567-570.

10monacoap,rertelsoncj,liechti-dallatis,etal.anexplanationforthephenotypicdifferencesbetweenpatientsbearingpartialdeletionsofthedmdlocus.genomics,1988,2:90-95.

11priortw,bartoloc,pearldk,etal.spectrumofsmallmutationsinthedystrophincodingregion.amjhumgenet,1995,57:22-33.

（收稿:1997-10-15修回:1998-03-27)

（责任编辑：jbwq）