国人常见的两种葡萄糖-6-磷酸脱氢酶基因突变及其临床表现

国人常见的两种葡萄糖-6-磷酸脱氢酶基因突变及其临床表现

中华儿科杂志1999年第12期第37卷论著

作者：何永蜀施进黄永坤龙莉杜传书

单位：何永蜀、龙莉昆明医学院生物学教研室650031；施进昆明医学院第二附属医院儿科；黄永坤昆明医学院第一附属医院儿科；杜传书广州中山医科大学遗传学研究室

关键词：葡糖-磷酸脱氢酶缺乏；基因扩增；突变

【摘要】目的探讨中国人中两种常见葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(g6pd)基因突变与临床表现的关系。方法应用突变扩增系统（arms）法，研究15例云南籍汉族g6pd缺乏症患儿两种常见g6pd基因突变，并对其临床表现进行分析。结果15例中检出cdnag1388a突变9例，cdnag1376t突变5例，未定型1例。所有患者都具有急性溶血性贫血，黄疸等临床表现及不同程度的血红蛋白尿、g6pd酶活性降低。结论g6pd基因cdnag1376t和cdnag1388a突变时具有相似的临床表现。

thetwocommong6pdgenemutationsinchineseandtheirclinicalmanifestations

heyongshu,shijin,huangyongkun,etal.

departmentofbiology,kunmingmedicalcollege,kunming650031

【abstract】objectivetoinvestigatetherelationshipbetweenthetwocommonglucose-6-phosphatedehydrogenase(g6pd)genemutationsinchineseandtheirclinicalmanifestations.methodsusingamplificationrefractorymutationsystem(arms)theauthorsdetectedthetwocommong6pdgenemutationsin15childrenofhannationalityfromyunnanprovince,andanalyzedtheirclinicalmanifestations.resultsnineoutof15caseswerefoundtohaveg1388amutation,5caseshadg1376tmutation,and1wasundefined.allthesecaseshadacutehemolyticanemia,jaundice,hemoglobinuriaandreducedg6pdactivitytodifferentextents.conclusionpatientswiththesemutationshavethesameclinicalmanifestations.

【keywords】glucosephosphatedehydrogenasedeficiencygeneamplificationmutation

遗传性红细胞葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(glucose-6-phosphatedehydrogenase，g6pd)缺乏症的基础研究已深入到分子水平。至1997年，全世界所报道的g6pd基因突变为122种以上，其中大多为点突变［1］。中国人中已报道的g6pd基因突变为14种，都为点突变，其中cdna1388（g→a）(g1388a)和cdna1376（g→t）(g1376t)突变占50%以上［2］，为中国人中最常见的g6pd基因突变类型。g6pd基因的各种突变所致的g6pd缺乏症具遗传异质性，临床表现呈个体差异。为探讨g6pd基因突变与临床表现的关系，我们通过突变扩增系统（amplificationrefractarymutationsystem，arms)方法检测云南省汉族g6pd缺乏症患儿cdna1388（g→a）和cdna1376（g→t）这两种中国人中最常见的突变，并对其临床表现进行分析。

对象和方法

一、对象

病例来源：15例g6pd缺乏症患儿均为男性，均为昆明医学院第二附属医院住院患儿，父系及母系三代居住云南，相互间无亲缘关系。发病诱因都是在蚕豆成熟季节进食蚕豆而发病，通过静脉血紫外分光光度计定量测定g6pd活性确定为g6pd缺乏症。

二、方法

1.临床实验室检查：（1）确定贫血程度［3］；（2）根据急性溶血的临床体征和既往史进行有关溶血的实验室检查，以排除其他因素所致的溶血。（3）g6pd活性测定，酶活性单位以每克hb含多少国际单位来表示（iu/g），正常值为4～7iu/g。

2.基因检测：dna制备：按常规法，蛋白酶k消化，酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)抽提，无水乙醇沉淀dna，te溶解。

pcr引物设计：arms法试剂盒由中山医科大学遗传研究室提供。引物序列为：

上游引物1388l2：5′gacctgacctacggcaacagatac3′

下游引物1388m2：5′ggtgcagcagtggggtgaaattat3′

1376m：5′tgaaaatacgccaggcctcaa3′

1388l2和1388m2特异性扩增g6pd基因第12外显子cdna1388（g→a）突变，扩增出361bp片段，而1388l2和1376m扩增cdna1376（g→t）突变，扩增出345bp片段。

基因扩增：30μl聚合酶链反应含基因组dna1.0μg，10×反应缓冲液3.0μl，dntps（2mmol/l）3.0μl，5′上游引物和3′下游引物各20ng，内对照引物40ng。反应条件为97℃变性7分钟，在85℃下加1.5ugdtaq酶后，进入热循环。循环条件为：94℃30秒，59℃45秒，72℃50秒，共25个循环，72℃继续保温7分钟。pcr在自动pcr仪（英国hyadi公司omn-e）中进行。

结果观察：6%聚丙烯酰胺凝胶电泳，选用1kbλdna作为dna分子量标准。银染，固定，干燥保存。

结果

一、患儿临床表现

本组15例g6pd缺乏症患儿均表现为急性进行性贫血、黄疸，发热5例，占33%。

二、基因检测结果

15例患儿中，g1376t突变者5例（图1），g1388a突变者9例（图2），未定型1例。显示g1388a和g1376t突变为云南省汉族g6pd缺乏症患儿基因突变的主要类型。

图1arms法检测1376(g→t)突变

1：1kb标准dna分子量；2，4：例1、例9患儿检测标本，扩增1376(g→t)突变的345bp片段和内对照4fr的196bp片段；3：为正常标本，仅见4fr的内对照的196bp片段

图2arms法检测1388(g→a)突变

1：1kb标准dna分子量；2，3：例4、例8患儿检测标本，扩增1388(g→a)突变的361bp片段及内对照4fr扩增的196bp片段；4～7：正常标本，只见4fr的196bp的内对照片段

三、临床实验室检测结果

14例已知基因型的g6pd缺乏症患儿中轻度贫血3例（21%）；中度贫血4例（29%）；重度贫血6例（43%）；极重度贫血1例（7%）；尿潜血试验阳性11例（79%）；14例患儿hb电泳全部正常，除外了hb异常所致的溶血性贫血（表1）。

表114例男性g6pd缺乏症患儿的实验室检测结果

例号年龄hb

（g/l）

rbc

（×1012/l）

血型g6pd活性

（iu/g）

基因

突变型

12岁10个月

67

2.52

a2.68g1376t

22岁953.36a1.39g1388a

33岁301.03b0.63g1388a

44岁491.66b2.10g1388a

55个月963.61a0.93g1388a

61岁6个月552.08b1.29g1388a

73岁653.31b2.30g1388a

86岁451.48b2.46g1388a

91岁9个月280.90b0.83g1376t

101岁5个月762.65a0.72g1388a

112岁2个月923.55a2.50g1376t

121岁2个月681.32b1.95g1376t

134岁56.32.05a1.45g1388a

142岁46.71.48b0.81g1376t

讨论

g6pd是参与磷酸戊糖旁路代谢产生还原型辅酶ⅱ（nadph）的关键酶。因g6pd基因突变引起的g6pd缺乏症是最常见的遗传病之一，其遗传方式为x连锁不完全显性遗传，女性杂合子表现度有很大差别，从表型正常到g6pd缺乏，因此人群中多见男性患儿。g6pd缺乏症具遗传异质性，各种点突变所致的表型变化范围宽广，临床表现从无症状到新生儿黄疸、药物诱导性溶血、蚕豆病，非球形细胞溶血性贫血(cnhsa)等。g6pd基因含13个外显子和12个内含子，编码515个氨基酸。g6pdcdna1388、cdna1376同属第12外显子，相距仅12个核苷酸，其突变在华人和华裔中有较高的发生频率。突变结果使459和463位的精氨酸分别被亮氨酸和组氨酸替代。据文献报道，导致严重临床症状的突变，大都位于g6pd结合区域或nadp结合区附近，g6pd缺乏症的严重程度与靠近nadp结合位点的突变有关，轻微的缺乏是由于突变位于决定g6pd末端的氨基酸所致［4，5］。459及463位精氨酸座落在10多个具高度保守的氨基酸区域中，其位置与nadp第一结合位点386～387位氨基酸在空间位置上相距很近，在酶与nadp的结合过程中起重要作用。但g1376t是一个较保守的氨基酸替换（arg-leu），预期它对g6pd酶活性的影响比较大［6］。g1376t突变总是伴随着脱氨nadp利用率的显著增高，而g1388a突变并不如此［7］。台湾学者在34例需要输血治疗的新生儿g6pd缺乏症患儿中发现g1376t突变占64.7%，发生新生儿高胆红素血症的g6pd缺乏症患儿g1376t突变占多数，提示有1376突变的患儿临床症状严重［8］。本组所有病例发病原因均因进食蚕豆引起，都具急性溶血表现，如进行性贫血，黄疸及不同程度的血红蛋白尿，患儿g6pd活性均低于正常，hb电泳排除异常血红蛋白所致的溶血性贫血。本组15例g6pd缺乏症患儿经基因检测，9例为g1388a突变，5例为g1376t突变。另1例患儿非上述两种突变，经同法arms检测，已排除a95g突变，其突变类型尚待确定。在这些患儿中检出的这两种突变是中国人中最常见的两种g6pd基因突变类型，表明突变具民族和地域性。所有这些患儿在发病后症状都较严重，临床表现严重程度与这两种g6pd基因突变型类型无关。发病原因与血型无关。患儿大多数经维持水、电解质平衡，碱化尿液等对症治疗即康复，仅部份患儿需要输血并合用肾上腺皮质激素治疗，患儿是否需要输血治疗由发病时贫血的严重程度决定。本组患儿g6pd基因g1376t和g1388a突变所致的临床表现没有明显区别，与谢建生等从前的报道一致［9］

基金项目：本课题受国家自然科学基金（项目编号：39670401）及云南省教委青年基金（项目编号：9841032）资助

参考文献

1vulliamya,luzzattol,hironoa,etal.hematologicallyimportantmutations:glucose-6-phosphatedehydrogenase.bloodcellmoldis,1997,23：302-313.

2杜传书，王青，陈路明，等.中国人中所见的六种葡糖-6-磷酸脱氢酶基因的点突变.中华血液学杂志，1993，14：395-398.

3吴瑞萍，胡亚美，江载芳，主编.诸福棠实用儿科学.第6版.北京：人民卫生出版社，1997.1664-1665.

4beutlere.glucose-6-phosphatedehydrogenasedeficiency.nengljmed,1991,324:169-174.

5chiudty,zuol,chaol,etal.molecularcharacterizationofglucose-6-phosphatedehydrogenase(g6pd)deficiencyinpatientsofchinesedecentandidentificationofnewbasesubstitutionsinthehumang6pdgene.blood,1992,81:2150-2154.

6杨明.人类g6pd缺乏症的分子生物学进展.中华医学遗传学杂志，1995:12,159-162.