干血纸片法用于葡萄糖-6-磷酸脱氢酶基因突变型的检测

干血纸片法用于葡萄糖-6-磷酸脱氢酶基因突变型的检测

中华儿科杂志2000年第7期第38卷论著

作者：区小冰佟莉贞张力余一平

单位：区小冰(510120广州市儿童医院检验科血液室)；佟莉贞(510120广州市儿童医院检验科血液室)；张力(510120广州市儿童医院检验科血液室)；余一平(510120广州市儿童医院检验科血液室)

关键词：葡糖磷酸脱氢酶缺乏；基因型；突变；聚合酶链反应；dna限制酶类

【摘要】目的了解广东人葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(g-6-pd)缺陷的基因突变型。探讨干血纸片法用于基因突变型诊断的效果。方法采用专用滤纸干血斑，运用5对特异性引物进行dna直接扩增、结合限制性内切酶分析技术对87例g-6-pd缺陷的住院患儿进行检测。结果87例患儿中30例（35%）为g1376t，28例（32%）为g1388a，6例（7%）为a95g，1例（1%）为g392t，未检出c1024t，尚有22例未能定型。结论g1376t、g1388a是广东人最常见的g-6-pd突变型。对急性溶血患儿，高铁血红蛋白还原率和g-6-pd酶活性（nbt法）假阴性时，干血纸片法可提高检出率。滤纸干血斑标本采集容易，直接进行dna扩增，方法简单，准确度高，值得在基因研究和临床诊断中应用推广。

examinationofglucose-6-phosphatedehydrogenasemutationtypeswithamethodofdriedbloodspotsonfilterpaper

ouxiaobing,tonglizhen,zhangli,etal.laboratorialdepartment,guangzhouchildren′shospital,guangzhou510120,china

【abstract】objectivetounderstandgenemutanttypesofglucose-6-phosphatedehydrogenase(g-6-pd)deficiencyamonglocalguangdongchildrenandtoevaluatethemethodusingdriedbloodspotsonfilterpaperinexaminationofpatientssufferedfromacutehemolyticanemiacausedbyg-6-pddeficiency.methodsthesubjectsofthisstudywere87hospitalizedchildrensufferingfromacutehemolyticanemiaepisodesbetween1993and1997.amongthesechildren,76weremaleand11werefemale.theageofthesecasesrangedfrom1.5moto10yearsand7mo.allthepatientswerediagnosedashavingg-6-pddeficientdiseaseonthebasisofclinicalsymptomsandthemethemoglobinreducingtestortheactivityofg-6-pdenzymes(nbtmethod).allthesepatientswerenativeguangdongpeoplewithoutbloodrelationtoeachother.peripheralbloodspecimenswerecollectedfromthefingertipsofthepatients,thenthebloodwasdroppedonasheetofspecialfilterpaper(s%26s)andthedetectionwasperformedafterdrybloodspotformed.directpcramplificationofthetargetgenesegmentwasperformedbyusing5pairsofspecialprimersdesignedagainst5g-6-pdmutanttypes:g1376t,g1388a,a95g,g392t,andc1024tfromdriedbloodspotonfilterpaper.theamplifiedproductswereaddedwithrelated5differentrestrictionendonucleases:bfrⅰ,ndeⅰ,miuⅰ,banⅰ,mboⅱ,andweredigestedat37℃overnight.theproductsobtainedafterdigestionwereanalyzedwithpolyacrylamidegelelectrophoresis.resultsthedetectionratesofdifferentgenemutanttypeswereasfollows:g1376t35%(30cases),g1388a32%(28cases),a95g7%(6cases),g392t1%(1case);c1024twasnotfound.in22casesthemutanttypescouldnotbedefined.of7caseswithacutehemolyticanemiawhohadnormalg-6-pdenzymeactivity(nbtmethod),5wereg1376t-positive,onewasg1388a-positiveandtheremainingonewasa95g-positive.conclusiong1376tandg1388aseemedtobethemostcommonmutanttypesofg-6-pdamongthesubjectsstudied.themethodofusingdriedbloodspotsonfilterpaperwasusefulforthepatientssufferedfromacutehemolyticanemiacausedbyg-6-pddeficientdisease.thismethodmayhavehigherdetectionratesthanmethemoglobinreducingtestandtheg-6-pdenzymeactivitytestswhichoftenshowfalsenegativeresults.thedrybloodspottesthastheadvantagesofeasytoperform,usingsmallquantityofbloodsample,convenienttotransportandstore,whichwouldmakedirectdnaamplificationsimpleandaccurate.thismethodappearstobesuitableformassscreeningforg-6-pddeficiency.

【keywords】glucosephosphatedehydrogenasedeficiency；genotype；mutation;polymerasechainreaction；dnarestrictionenzymes

目前国内对葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（glucose-6-phosphatedehydrogenase,g-6-pd）基因突变型的检测方法有寡核苷酸探针斑点杂交技术，pcr产物dna单链构象多态技术、等位基因特异性扩增和内切酶分析法等。而干血纸片法检测只用于新生儿筛查［1］。我们运用5种特异性引物，采用滤纸干血斑直接dna扩增结合内切酶分析技术，对87例g-6-pd缺陷症引起急性溶血的患儿进行了检测。

对象和方法

一、对象

87例均为我院1993～1997年因急性溶血性贫血发作而住院的患儿，其中男性76人，女性11人，年龄从1个半月～10岁7个月，经临床症状和高铁血红蛋白还原率或g-6-pd酶活性测定(nbt法)确诊为g-6-pd缺陷症［2］，相互间无亲缘关系，广东籍人。

二、方法

1.标本采集:采患儿手指尖血，直接滴在新生儿筛查用滤纸(s%26s)上，形成约1cm直径的血斑，每个患儿取6个血斑备用，待血斑自然干燥后用塑料袋装好，放-20℃冰箱内保存（滤纸由台北荣民总医院医学研究部萧广仁博士提供）。

2.引物及限制性内切酶:针对5种不同的点突变所设计的5对特异性引物：g1376t，g1388a，a95g，g392t，c1024t（序列从略［3,4］，由萧广仁博士提供），及相应的5种内切酶：bfrⅰ，ndeⅰ，mluⅰ，banⅰ，mboⅱ(均为美国promega公司产品)(表1)。

表15种突变类型相应的内切酶及酶切结果

突变类型限制性内切酶切点酶切片段大小（bp）

正常突变

g1376tbfrⅰc/ttaag169,12153,16,12

g1388andeⅰca/tatg220200,20

a95gmluⅰa/cgcgt126,1399,27,13

g392tbanⅰg/gpypucc262,59237,59,25

c1024tmboⅱgaaga(n8)/162,22125,37,22

3.聚合酶链反应:取直径3mm的滤纸干血斑，先经甲醇∶丙酮（1∶1）混合液处理，置60℃烤箱8～10min待溶剂挥发，然后加入pcr反应所需的各种试剂（taqdna聚合酶除外），95℃水浴10min，60℃水浴20min，最后加入taqdna聚合酶进行pcr循环，反应总体积30μl。各组分的终浓度为：datp、dgtp、dctp、dttp各0.2mmol/l,mgcl2：2mmol/l,上下游引物各0.2μmol/l,1×缓冲液（taqdna聚合酶厂家提供），1utaqdna聚合酶（promega公司产品）。pcr反应在dna扩增仪（hema480）上自动进行：95℃、1min，59℃、1min，74℃、30s，1个循环；95℃、1min，58℃、1min，74℃、30s，1个循环；95℃、30s，58℃、50s，74℃、30s，33个循环；最后74℃延伸5min。结果观察：取pcr产物5μl与1μl上样液混合，2%琼脂糖电泳，溴化乙锭染色，紫外灯下观察结果。

4.限制性内切酶分析:取pcr产物5μl，用相应的内切酶4u及相应缓冲液，总体积20μl，在酗37℃消化过夜，消化产物用8%聚丙烯酰胺凝胶电泳，溴化乙锭染色后置紫外灯下观察结果。结果

一、各基因突变型的检出率

在检测的87例患儿滤纸干血斑中，有65例（75%）分别属于下列4种不同的基因突变型：g1376t，g1388a，a95g，g392t，未发现c1024t,有22例（25%）尚未能定型。结果见表2。

表287例g-6-pd缺陷症患儿基因突变类型

突变类型氨基酸置换例数百分比（%）

g1376targ→leu

30

35

g1388aarg→his2832

a95ghis→arg67

g392tgly→val11

c1024tleu→phe00

未知未知2225

合计

87

100

二、患儿高铁血红蛋白还原率或g-6-pd酶活性(nbt法)的检测情况

本组7例因药物或进食蚕豆诱发急性溶血，临床诊断为g-6-pd缺陷的患儿中，2例高铁血红蛋白还原率正常，g-6-pd酶活性(nbt法)低下；1例高铁血红蛋白还原率低下，g-6-pd酶活性(nbt法)正常，经检测证实均属g1376t突变型。另4例高铁血红蛋白还原率和g-6-pd酶活性(nbt法)均正常，分别为g1376t2例，g1388a和a95g各1例。

三、c392t突变型酶切结果

我们采用滤纸干血斑直接dna扩增，限制性内切酶分析法是根据点突变性质［3，4］应用了不完全配对的pcr引物，扩增反应后使其形成一个新的内切酶位点和一个内质控切点，经相应的内切酶切割后，形成与正常的pcr产物被切割后不同的片段(图1)。

讨论

本组结果表明：87例g-6-pd缺陷患儿中，分别属于4种突变型的有65例，未定型有22例，可能是其他的突变型不在本组检测范围，因此我们认为此法亦适合用于g-6-pd缺陷引起急性溶血的患儿。本组中c1376t占35%，g1388a占32%,两种共占67%,与杜传书、谢建生、何永蜀等［5-7］学者用不同的方法在不同的地区检出的52.8%、62%和68%，台湾人中占71.3%的结果基本相同［3］，都超过半数以上。也说明这两种基因突变型是中国人g-6-pd缺陷的主要突变型。本组未发现c1024t,据报道其发生率是1.8%和5.6%［1，5］，提示可能g-6-pd基因突变点不同，其诱发溶血因素可能也不同，前两种突变型易发生溶血，而后者却少见。

m：dna分子量标准；1：pcr产物未与内切酶反应；2：正常pcr产物与内切酶反应；3：g392t突变型pcr产物与内切酶反应

1g392t突变型酶切分析电泳图谱

从本组结果可看出,在临床发生急性溶血的病例,如实验室检查高铁血红蛋白还原率和g-6-pd酶活性(nbt法)出现假阴性,或两种方法检查结果不一致而不能确诊时,运用此法进行dna检测,可提高g-6-pd缺陷症的检出率。

用滤纸干血斑直接进行dna扩增的优点是：采集标本容易，无需抽血，仅用指尖几滴血，用血量少，可在不同的时间收集标本储藏起来，在适当的时候进行检测。滤纸干血斑标本运输极为方便，操作时无需dna抽提的繁锁步骤，避免了交叉污染。适用于大量的普查工作。滤纸干血斑标本直接dna扩增，结合内切酶分析法具有方法简单易掌握，准确性好，灵敏度高，结果易判断，值得在基因研究和临床诊断方面应用和推广。

参考文献

1，唐东江，马燮琴，宋诚燕，等.干血纸片法用于广东人g-6-pd基因点突变筛查研究.中华血液学杂志，1998，19：189-191.

2，杜传书，芮琳.红细胞葡萄糖-6-磷酸脱氢酶活性四氮唑蓝定量法.中华血液学杂志，1981，2：188.

3，changjg,chiouss,perngli,etal.molecularcharacterizationofglucose-6-phosphatedehydrogenase(g-6-pd)deficiencybynaturalandamplificationcreatedrestrictionsites:fivemutationsaccountformostg-6-pddeficiencycasesintaiwan.blood,1992,80:1079-1082.

4，tangkt,huangcs,huangmj,etal.diversepointmutationsresultinglucose-6-phosphatedehydrogenase(g-6-pd)polymorphismintaiwan.blood,1992,79:2135-2140.