α-地中海贫血的产前基因诊断

时间 : 2015-12-04 14:23:27 来源：放心医苑网

[摘要]

地中海贫血的产前基因诊断中华妇产科杂志1998年第3期第0卷论著作者：张秀泉　李全贞　吴艳　何蕴韶　朱承明　周新宇单位：510630广州，中山医科大学附属第三医院妇产科(张秀泉，吴艳，朱承明)；中山医科大学达安基因诊断中心(李全贞，何蕴韶，

α-地中海贫血的产前基因诊断

中华妇产科杂志1998年第3期第0卷论著

作者：张秀泉李全贞吴艳何蕴韶朱承明周新宇

单位：510630广州，中山医科大学附属第三医院妇产科(张秀泉，吴艳，朱承明)；中山医科大学达安基因诊断中心(李全贞，何蕴韶，周新宇)

关键词：α地中海贫血；产前诊断；基因；聚合酶链反应

【摘要】目的研究聚合酶链反应(pcr)技术在α地中海贫血产前诊断中的价值。方法应用pcr技术，对11例父母双方均为α珠蛋白基因缺失杂合子的胎儿(1例双胎)行羊水产前基因诊断，扩增产物中出现224bpdna片段为正常α类珠蛋白基因序列，出现630bpdna片段的扩增带代表有α类珠蛋白基因缺失，若同时出现224bp和630bp两个dna片段的扩增带，则表示为杂合子。结果3例胎儿表现为基因正常序列(αα/αα)，4例胎儿为杂合子(--/αα)(其中1例为双胎之一)，4例胎儿为纯合子(--/--)(其中1例为双胎之一)。b超检查疑有胎儿水肿的3例胎儿，经基因诊断仅有2例为纯合子，而另外1例为杂合子。引产的4例胎儿为纯合子α-地中海贫血，其中有1例全身水肿，2例为典型的bart′s水肿儿，1例四肢短小、腹疝形成。结论pcr技术用于α-地中海贫血的产前诊断，具有快速、准确的特点。

prenatalgenediagnosisofalpha-thalassemiaszhangxiuquan*,liquanzhen,wuyan,etal.*thethirdaffiliatedhospital,sunyet-senuniversityofmedicalsciences,guangzhou510630

【abstract】objectivetostudythevalueofpolymerasechainreaction(pcr)inprenataldiagnosisofalphathalassemias.methodsamnioticfluidprenatalgenediagnosiswithpolymerasechainreactionwascarriedoutonelevenfetuseswhoseparentsarebothheterozygoteswithalpha-globingenedeficiency.adnafragmentof224bpintheproductionmeansnormalalpha-globingenesequence,whilea630bpfragmentindicatedthealpha-globingenedeficiency.both224bpand630bpfragmentsinthesamesamplemeansheterozygote.resultsthreeofthe11fetuses(onepregnancywastwin)werewithnormalalpha-globingenesequence,while4werehomozygotesandtheother4wereheterozygotes.forthe3fetuseswithasciticfluidunderultrasoundexamination,2werehomozygotesandtheotheronewasheterozygotebygenediagnosis.twoofthe4homozygotesfrominducedabortionweretypicalbart′ssyndrome,onewasedemainthewholebodyandtheotheronewithshortlimbsandabdominalhernia.conclusionthemethodofpcrinprenataldiagnosesfordetectionofα-thalassemiasissimple,accurateandrapid.

【keywords】alpha-thalassemiasprenataldiagnosisgenepolymerasechainreaction

α-地中海贫血(α-地贫)是常见的遗传性疾病之一，广东省普查资料表明，α-地贫杂合子发生率为7.3%，广西和海南发生率更高［1］。此病目前尚无有效方法治疗，但随着分子生物学技术的发展，对其进行产前诊断，减少胎儿水肿综合征(bart′s水肿)患儿的出生已成为现实。我们根据广东地区α-地贫基因病变绝大多数为东南亚基因缺失型的特点［2～4］，设计了检查东南亚型α-地贫基因缺失型的3个聚合酶链反应(pcr)引物，通过pcr特异性扩增胎儿dna，根据扩增产物分析检出α-地贫的正常基因、杂合子和纯合子。我们对需要进行产前诊断的11例胎儿作了α-地贫的产前诊断。现报道如下。

资料和方法

一、资料

1996年3月～1997年3月在遗传优生门诊中，共筛查并经基因诊断夫妻双方均为α-地贫基因携带者10对，其中3对因分娩过bart′s水肿儿、1对因分娩过畸型儿而就诊，6对因产前检查怀疑轻型α-地贫，均作基因分析后确诊，于孕期作产前诊断。其中1例为双胎，共11个胎儿。孕妇年龄24～35岁，孕期13～30周。

二、方法

1.标本获取：10例孕妇均于孕期在b超引导下行羊膜腔穿刺获取羊水5～10ml。

2.pcr引物的设计：根据广东地区α-地贫基因改变为大片基因缺失的特点，我们设计了检查东南亚型α-地贫基因缺失型的3个pcr引物，分别为：αu：5′aactcggtcgtccccactgtcgtc3′；αm:5′gacacgttccaatacgctta3′;αd:5′atatatgggtctggagtgtatc3′。αu与αm或αu与αd分别构成pcr引物对，前者扩增正常人α类珠蛋白基因序列dna，产生224bpdna片段；后者扩增α类珠蛋白基因缺失患者dna序列，产生约630bpdna片段。扩增产物中只有224bp片段为正常，只有630bpdna片段为缺失纯合子(bart′s水肿儿)，若同时出现224bp和630bp两个片段的扩增带，则表示为杂合子。

3.pcr条件［5］：反应总体积为25μl，含引物分别为25pmol/l(αu和αm扩增时)和25pmol/l(αu和αd扩增时)，1μg样品dna，10mmol/ltris-hcl(ph8.3)，2.0mmol/lmgcl2，50mmol/lkcl，5.0mmol/l(nh4)2so4，0.2mg/ml明胶，以及各200μmol/l的datp、cctp、dgtp和dttp。反应时在93℃下变性5分钟，55℃退火3分钟，加1utaq聚合酶。93℃，45秒；55℃，45秒；72℃，90秒，循环30次，最后在72℃下延伸5分钟。取10μlpcr反应液，经2%琼脂糖凝胶电泳30分钟，染色后在紫外线灯光下观察结果。

4.结果观察：与标准分子mark作对照，单独出现224bpdna片段扩增带时，表示有正常的基因序列(αα/αα)；单独出现630bpdna片段扩增带时，表示纯合子α珠蛋白基因片段缺失(－－/－－)；当224bpdna片段和630bpdna片段扩增带同时出现时，则表示为杂合子α珠蛋白基因片段缺失(－－/αα)。

结果

10对夫妇基因均表现为α珠蛋白基因缺失杂合子(－－/αα)。胎儿羊水检查有3例胎儿表现为基因正常序列(αα/αα)，3例胎儿表现为α珠蛋白基因缺失杂合子(－－/αα)，3例表现为α珠蛋白基因缺失纯合子(－－/－－)，另有1例双羊膜囊双胎，其胎儿基因分别为缺失纯合子(－－/－－)和杂合子(－－/αα)。见附表。

附表10例α地贫基因携带者临床情况及基因诊断结果

病例序号年龄孕周临床表现产前基因

诊断结局13530曾分娩水肿儿，

夫妻均为杂合子αα/αα正常儿22728筛查，夫妻均为

杂合子αα/αα正常儿33414曾分娩水肿儿，

夫妻均为杂合子－－/－－bart′s水肿儿42420筛查，夫妻均为

杂合子、双胎－－/αα

－－/－－表型正常

四肢短小，腹疝53323曾分娩水肿儿，

夫妻均为杂合子－－/－－全身水肿62613曾分娩畸形儿，

夫妻均为杂合子αα/αα正常儿72819筛查，夫妻均为

杂合子－－/－－bart′s水肿儿82726筛查，夫妻均为

杂合子－－/αα表型正常92614筛查，夫妻均为

杂合子－－/αα表型正常102916筛查，夫妻均为

杂合子－－/αα表型正常讨论

一、α-地贫的病理基础及危害

地中海贫血是由于珠蛋白链合成不平衡所造成的一类遗传性疾病，bart′s水肿综合征是地中海贫血中最严重的一种，它是由于第16号染色体上的4个α珠蛋白基因全部缺乏，从而导致α珠蛋白链的完全缺失，γ珠蛋白则自身聚合成四聚体即bart′s血红蛋白，这种血红蛋白对氧亲和力极强，在组织中难以释放氧，致使胎儿大多在出生时就窒息死亡；地中海贫血α珠蛋白基因缺失表现为杂合子时，血红蛋白对氧的亲和力也比正常的血红蛋白强，尽管胎儿出生后可以发育成人，但其身体发育等可受到一定的影响，而且这种影响程度与珠蛋白基因缺失的多少成正相关［6］。地中海贫血在中南沿海地区较常见，给孕妇的身心健康造成极大的创伤。

地中海贫血为隐性遗传性疾病，只有当α珠蛋白基因完全缺失(纯合子)时，才会表现为bart′s水肿综合征，新生儿不能存活；而当α珠蛋白链部分缺失时，新生儿可以存活，并基本上象成人一样的生活。因此，地中海贫血产前诊断的目的就是要杜绝纯合子胎儿的出生，减少杂合子胎儿的出生。由于目前对此病的治疗尚无有效的方法，所以除加强遗传咨询、婚姻指导外，最根本的措施是进行产前常规筛查和产前诊断，及时引产纯合子胎儿，以达到优生的目的。只有当夫妻双方都为α-地贫杂合子时才可能出现纯合子的胎儿。所以，地中海贫血产前诊断的重点对象就是夫妻双方均为杂合子的孕妇。

二、α-地贫的产前诊断

在基因诊断方法建立以前，地中海贫血的确诊是通过采集胎儿血液，经体外培养后测定各珠蛋白链的合成速率来进行诊断的，该方法会引起胎儿失血、围产儿死亡率增高。随着分子生物学发展，地中海贫血的基因诊断已经建立［3］，为临床工作者的确诊提供了可靠的方法，本组10例孕妇地中海贫血的产前诊断，分娩后或引产后均经过临床证实和/(或)基因诊断证实，3例胎儿正常，4例胎儿为杂合子(含双胎1例)，4例胎儿为纯合子(含双胎1例)。

地中海贫血夫妻双方均为杂合子时，其子代有1/4基因正常，1/2为杂合子，1/4为纯合子，本组报道的11例胎儿(1例为双胎)，有3例正常基因型、4例基因为杂合子。b超对bart′s水肿的诊断有重要的参考意义［7］，10例孕妇中有3例先由b超发现胎盘增厚和(或)胎儿腹水，后行基因诊断。值得注意的是b超检查疑有水肿的3例胎儿，经基因诊断仅有2例为纯合子，而另外1例b超显示少量腹水的胎儿经基因诊断为杂合子，引产及出生后均得到证实。可见，基因诊断才是决定可疑地中海贫血胎儿是否存留的最可靠方法。

纯合子地中海贫血的胎儿，外观可表现为典型的bart′s水肿儿，也可以不十分典型，本组有1例孕妇，主诉为曾生育一畸形儿(病理解剖为：双侧多囊肾、输尿管缺如、脐尿瘘)。引产出的4例胎儿有1例全身水肿，2例典型的bart′s水肿，1例四肢短小、腹疝形成。

在采用红细胞脆性试验和血红蛋白电泳的基础上，对夫妻双方基因型均已确诊者，应用pcr技术作地中海贫血的产前诊断，准确可靠，操作简便迅速，可在2天内出报告。特别在我国沿海地区地中海贫血的类型多为东南亚缺失型，本方法值得推广应用。

参考文献

1杜传书.地中海贫血研究的现状与未来.中华医学遗传杂志,1996,13:257-258.

2higgssr,vickersma,wilkieaom,etal.areviewofthemoleculargeneticsofthehumanα-globingenecluster.blood,1989,73:1081-1084.

3chanay,sock,chanlc.comparisonofthehbhinclusiontestandapcrtestinroutinescreeningforalphathalassaemiainhongkong.jclinpathol,1996,49:411-413.

4gladerbe,lookka.hematologicdisordersinchildrenfromsoutheastasia.padiatrclinnortham,1996,665-681.

5徐湘民，蔡旭恒，李坚，等.聚合酶链反应技术用于缺失型α地中海贫血的分子筛查和产前诊断.中华医学杂志，1994，74：495-497.

6lemmencezm,eigela,helbigb,etal.prevalenceofalphathalassemiasinnorthernthailand.humengenet,1996,98:345-347.

7kotm,tsenglh,hsupm,etal.ultrasonographyscanningofplacentalthichnessandtheprenataldiagnosisofhomozygousalpha-thalassaemia1inthesecondtrimester.prenataldiagnoses，1995,15:7-10.

(收稿：1997-05-26修回：1997-12-18)

（责任编辑：jbwq）