应用免疫荧光技术对眼瘢痕性类天疱疮的研究

　　应用免疫荧光技术对眼瘢痕性类天疱疮的研究

　　眼科研究2000年第2期第18卷实验研究

　　作者：赵普宁　Thanh　Hoang-xuan　Hervé　Robin

　　单位：赵普宁（570311海口，海南省人民医院眼科）；ThanhHoang-Xuan（法国巴黎国立BICHAT大学医院中心）；HervéRobin（法国巴黎国立BICHAT大学医院中心）

　　关键词：免疫荧光；眼瘢痕性类天疱疮

　　摘要　目的探讨免疫荧光技术对眼瘢痕性类天疱疮（OCP）的实验诊断意义。

　　方法应用直接免疫荧光（DIF）检测16例OCP患者的结膜和应用间接免疫荧光（IIF）以鼠食道和正常人结膜为基质检测34例OCP患者的血清。

　　结果DIF证实6例结膜上皮细胞基底膜上有免疫复合物（IgG和／或IgA）和／或C3呈线状沉积。以结膜为基质的IIF证实血清中抗基底膜（BMZ）抗体4例，抗细胞间物质（IIS）抗体14例，总阳性率为52.9%，而以鼠食道为基质的IIF阳性率为38.2%。

　　结论DIF对诊断眼瘢痕性类天疱疮是有用的；IIF也有助于眼瘢痕性类天疱疮的诊断及疗效评估；孤立的上皮内自身免疫瘢痕性结膜炎可能为一新的类型。

　　分类号　R770．3

　　ImmunofluorescentstudiesonocularcicatricialpemphigoidZhaoPuning，ThanhHoang-Xuan，Herv%26eacute;Robin．　　DepartmentofOphthalmology，People’sHospitalofHainanProvince，Haikou570311

　　AbstractObjectiveTostudytheusefulnessofimmunofluorescenttechniqueforthediagnosisofocularcicatricialpemphigoid．MethodsThirty-fourpatientswithocularcicatricialpemphigoidwerestudiedbyindirectimmunofluorescence（IIF）ontheirserawithratesophagusandnormalhumanconjunctivaastissuesubstrates．Directimmunofluorescence（DIF）wasperformedontheconjunctivalbiopsyspecimensof16patients．ResultsIn6casesofthe16patients，DIFofconjunctivashowedalineardepositionofimmunoreactants（IgGand／orIgA）and／orC3onthebasementmembranezone（BMZ）．Ofthe34patients，4haddetectablecirculatinganti-BMZantibodies，14and7patientsdemonstratedantibodiesbindingtotheintraepithelialintercellularsubstance（IIS）ofhumanconjunctivaandratesophagus，respectively．ThepositiverateofIIFonhumanconjunctivais52.9％andonratesophagus38.2％．ConclusionsDIFisusefulforthediagnosisofocularcicatricialpemphigoid．IIFalsocanhelpforthediagnosisandtheevaluationofthetreatmentofocularcicatricialpemphigoid．Isolatedintraepithelialautoimmunefibrozingconjunctivitismaybeanewentity．

　　Keyword　simmunofluorescenceocularcicatricialpemphigoid

　　眼瘢痕性类天疱疮（ocular　cicatricial　pemphigoid，OCP）是以慢性进行性结膜瘢痕形成为特征的自身免疫性疾病［1，2］，它可引起结膜穹隆缩短，内翻倒睫，附属泪腺损害，角膜和结膜角化，睑球粘连，最终导致失明，法国称之为眼假性天疱疮或Lortat-Jacob病。该病没有地理和种族差异，以老人和女性患病多见。临床上常根据其临床特征而予以诊断，免疫抑制剂治疗有效。近年来研究证实该病的自身免疫性特征：在皮肤和粘膜上皮细胞的基底膜有免疫球蛋白（主要是IgG）和补体的沉积［1～4］，但国内对该病的认识和文献报道甚少。现将作者于1996年在法国巴黎国立BICHAT大学医院中心进修时应用免疫荧光技术对眼瘢痕性类天疱疮所做的部分研究报告如下。

　　1　资料与方法

　　1．1　病人及眼科检查

　　收集1994～1996年34例符合眼瘢痕性类天疱疮临床诊断标准者，并根据Tauber和Foster分级法予以临床分级［5，6］。

　　眼瘢痕性类天疱疮临床诊断标准：不明原因的双眼非对称性慢性进展性结膜收缩，穹隆缩短，最后导致睑球粘连，睑内翻倒睫，干眼症和角膜混浊。可仅出现眼部病变，也可伴有全身其他部位的皮肤或粘膜损害，如口腔粘膜的水泡或大疱，可破溃形成瘢痕；头面部的有水泡的红斑，愈合后遗留光滑的萎缩性瘢痕；或腹股沟及肢体的复发性无瘢痕的暴发性囊疱。

　　眼瘢痕性类天疱疮临床分级（Tauber和Foster分级法）：

　　Ⅰ：慢性结膜炎，结膜下瘢痕和纤维化。

　　Ⅱ：出现任何程度的穹隆缩短，并根据下穹隆深度丧失的范围细分为A（0～25％），B（25％～50％），C（50％～75％），D（75％～100％）。

　　Ⅲ：出现任何程度的睑球粘连，并根据睑球粘连所累及的水平范围细分为A（0～25％），B（25％～50％），C（50％～75％），D（75％～100％），记录睑球粘连带的数目。

　　Ⅳ：睑缘粘连，睑球固定。

　　1．2　活检

　　（1）其中16例病人（男性5例，女性11例）行结膜活检，均选择病变较严重眼，于局麻下取上方角膜缘附近球结膜5mm×2mm，放入生理盐水中，立即作直接免疫荧光（immunofluorescence，DIF）检查，术眼不需缝合，涂抗生素糖皮质激素眼膏，包眼24h。

　　（2）正常结膜取自单纯老年性白内障而无其他皮肤粘膜疾病患者，在白内障摘出手术中，以同样方式取球结膜，迅速包埋，作5μm冰冻切片，－80℃低温保存待用。　　（3）取鼠内脏组织（肝、食道等）同法作快速冰冻切片，低温保存待用。

　　1．3　血清

　　34例病人（男性10例，女性24例）均抽血制备血清，分装多个小管（每管约0.5ml），－80℃保存，待行间接免疫荧光（IIF）检查。

　　1．4　直接免疫荧光法

　　根据Foster的方法［1］行直接免疫荧光检查。

　　将所取病人结膜迅速包埋于OCT（USA）中，作5μm冰冻切片；应用荧光素结合的羊抗人IgG，IgA，IgM，C3（Berhing），滴度1∶10，室温下30min；PBS浸洗两次各20min；盖玻片固定，立即于荧光显微镜下读片，记录结果。

　　1．5　间接免疫荧光法

　　根据常规方法行间接免疫荧光检查［3］。　　从低温冰箱中取出病人血清和正常人结膜切片，置室温1h；同时取鼠食道切片，置干燥器30min；病人血清1∶10滴盖正常结膜切片和鼠食道切片，室温孵育30min；PBS浸洗2次各10min；荧光素标记的羊抗人IgG，IgM，IgA（Dako）1∶10，30min；PBS浸洗2次各10min；盖玻片固定，立即荧光显微镜下读片，记录结果。以正常人血清和已确诊为眼瘢痕性类天疱疮的病人血清分别作阴性和阳性对照。

　　2　结果

　　2．1　16例患者行直接免疫荧光法和间接免疫荧光法两种检查，且已查到详细的病历资料，见表1。其中男性（M）5人，女性（F）11人；年龄37岁至90岁不等，平均年龄72岁；单纯结膜受累（C）9例，合并皮肤（S）或口腔（O）粘膜受累7例；临床分级均在Ⅱ级以上。　　直接免疫荧光法证实结膜上皮细胞基底膜上有免疫复合物呈线状沉积（主要是IgG，其次为IgA，C3，IgM）有6例，阳性率占37.5%。

　　表1　16例DIF与IIF检查结果一览

　　Tab．1　The　results　of　DIF　and　IIF　in　16　cases

　　间接免疫荧光法检测血清中抗基底膜（basement　membrane　zone，BMZ）抗体阳性3例（18.7%），抗细胞间基质（intraepithelial　intercellular　substance，IIS）抗体阳性6例（37.5%），主要是IgG，其次为IgA，总阳性率为56.25%。　　直接免疫荧光法与间接免疫荧光法间无明显对应关系。

　　2．2　34例病人行人结膜和鼠食道为基质的间接免疫荧光检查，男性10例，女性24例，以结膜为基质的血清中抗基底膜抗体阳性4例（11.76%），抗细胞间物质抗体阳性14例（41.17%），总阳性率为52.9%，主要是IgG，其次是IgA，而IgM均为阴性。以鼠食道为基质的阳性率为38.2%，阳性间有一定的对应关系。

　　3　讨论

　　瘢痕性类天疱疮（cicatricial　pemphigoid，CP）是一种上皮下自身免疫性大疱病，常同时累及皮肤和粘膜，约70%的瘢痕性类天疱疮出现眼部病变，故临床上常以OCP来统称自身免疫性结膜炎。眼瘢痕性类天疱疮生物显微镜下可以观察到，并可根据下穹隆深度丧失及睑球粘连水平累及范围及粘连带数目进行临床分级，以评价收缩程度、进展及治疗效果［6］。现在临床上非典型病例逐渐增多，尤其是单纯结膜病变的病例（本文中占56.25%），很难鉴别诊断。国外近年已开展应用直接免疫荧光法作为眼瘢痕性类天疱疮的实验诊断方法，阳性率为20%～84%［3，4，7］，而国内眼科界对此病的研究仅限于临床个例报告。本文应用直接免疫荧光技术检测结膜上皮细胞基底膜上免疫球蛋白的沉积，阳性率为37.5%，与文献报道相符。

　　间接免疫荧光法可以证实血清中抗皮肤或粘膜（包括结膜）的抗体，简便灵活，且可避免活检的繁琐和避免加重结膜瘢痕的形成，但研究结果常为阴性或不稳定［1，3，6，8，9］。极可能的解释是所用于间接免疫荧光技术中的基质较差，而理想的基质应是人结膜组织［8］。本文应用人结膜为基质的间接免疫荧光法检测血清中抗结膜抗体，阳性率高达52.9%，且与以鼠食道为基质的IIF阳性之间有相应关系，重复实验结果稳定，与合作课题皮肤组的实验结果相符，而目前国际上尚无应用人结膜为基质的间接免疫荧光法检测自身免疫性结膜疾病的研究报道。作者认为在有可能获得正常人结膜的条件下，将间接免疫荧光技术作为眼瘢痕性类天疱疮的实验诊断方法之一是可行的，并可在疾病和治疗的不同阶段进行多次检测，以观察治疗效果及疾病的发展，判断预后。

　　值得注意的是应用间接免疫荧光技术，有相当一部分是抗细胞间物质抗体阳性，以前也有类似报道［10］，分析可能是由严重受损的上皮产生的天疱疮样抗体（抗细胞间物质抗体）；也有可能这些病人患的是寻常型天疱疮而眼部表现为眼瘢痕性类天疱疮（寻常型天疱疮为上皮内自身免疫性大疱病，一般只影响皮肤）；还极有可能是存在一种新的类型，即不伴有自身免疫性皮肤病的上皮内自身免疫性瘢痕性结膜炎。事实上，仅凭眼科临床表现是很难区分不同类型的自身免疫性结膜炎的，而且其抗原特性和发病机理尚不清楚，均有待于进一步深入研究。

　　1，FosterCS．Cicatricialpemphigoid．TransAmOphthalmolSoc，1986，84∶527

　　2，PowerWJ，NevesRA，RodriguezA，etal．ConjunctivalBiopsyinOcularCicatricialPemphigoid．Ophthalmology，1995，102∶1158

　　3，LeonardJN，HobdayCM，HaffendenGP．Immunofluorescentstudiesinocularcicatricialpemphigoid．BrJOphthalmol，1998，118∶209

　　4，ElderMJ，LightmanS．Theimmunologicfeaturesandpathophysiologyofocularcicatricialpemphigoid．Eye，1994，8∶196

　　5，TauberJ，JabburN，FosterCS．Improveddetectionofdiseaseprogressioninocularcicatricialpemphigoid．Cornea，1992，11∶446

　　6，MondinoBJ．Cicatricialpemphigoidanderythemamultiforme．Ophthalmology，1990，97∶939