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摘　要：成人多囊肾是一种发病率高、病情严重、分布广泛的一种疾病，它在遗传上有异质性。近几年，随着对引起该疾病的主要基因PKD1和PKD2的克隆测序完成，对于这两个基因的基因结构、分子机理和该疾病的基因诊断研究取得了重大的进展。本文拟就对这些进展作以综述。
　　关键词：成人多囊肾　成人多囊肾基因　基因诊断
　　成人多囊肾（APKD）是一种常见的遗传病，主要临床症状是在肾脏中出现多发性囊肿，偶尔也会累及肺、脾、卵巢等部位。因为它是以常染色体显性方式遗传所以又称染色体显性多囊肾病（ADPKD）。现在已经发现并确定了两个基因（PKD1和PKD2）与此病有关，其中因为PKD1基因突变而导致ADPKD约占85%～90%。另外，人们还发现非PKD1非PKD2的成人多囊肾病家族，说明至少还有PKD3基因的存在[1]。本文拟就成人多囊肾病分子研究的最新进展作以综述。
1PKD1基因及其蛋白
　　PKD1基因于1985年就被定位于染色体16p13.3处，并且依此开展了基因连锁分析来进行基因诊断，1995年欧洲多囊肾病协作组通过对一个染色体易位家族的分析，发现16号染色体与22号染色体的易位造成了PKD1基因的断裂而导致了ADPKD。克隆测序得知该易位断裂点上有一个14kbmRNA转录产物的基因，也就是PKD1基因的待定基因，这一结论在其它患者身上得到进一步的证实[2]。
　　PKD1基因约50kb，有46个外显子，编码一个14kbmRNA，蛋白产物为一个个氨基酸的膜内在性蛋白。该基因的3'端是单拷贝序列，而在5'端的32个外显子附近有三个重复的序列（HG位点），它们之间有97%的同源性。PKD1基因在进化上有高度的保守性，在啮齿动物中发现了同源序列。因此对小鼠的PKD1同源基因进行研究可以使人们对ADPKD的发病机理有更深的理解[3]。
　　PKD1基因的蛋白产物被称为多囊蛋白（polycystin），不是以前所发现的任何一种基因家族的成员。它的大部分结构域在细胞外，与其它蛋白或糖类结合，当然，也有潜在的穿膜序列。该分子主要参与细胞与细胞之间，细胞与基质之间的相互作用，这与多囊肾病的异常病症是一致的[3]。
　　这个蛋白包含着几个结构花式，这几种结构花式的功能以前都已经知道。他们分别是信号肽序列，引导蛋白在膜上定位；富含亮氨酸重复区（leucine-richrepeats,LRRs），参与信号传递；糖基识别域（crbohydraterecognitiondomain,CRD），与糖基结合，负责细胞粘着；半胱氨酸富集区，为低密度脂蛋白A配体粘着区；PKD结构域，一个高度糖基化的细胞外结构域[3]。
　　为了验证多囊蛋白的细胞粘着功能和跨膜结构域，VanAdelsberg等人制造了针对这个蛋白的跨膜非重复部分的抗体进行了Western印迹分析和免疫荧光分析，发现在胎儿肾中的表达高于成人。在胎儿肾中，多囊蛋白定位于输尿管芽，弧型和S型小体的质膜上，然而在胎儿更为成熟的小管，成人肾和多囊肾中，多囊蛋白主要存在于细胞之间。这意味着该蛋白在肾发生过程中扮演了一个重要的角色[4]。
　　在这个基因克隆后，许多人对其突变进行了大量分析，然而，由于该基因所在区域有其重复序列，传统的突变检测方法是无法进行分析的。现在所发现的突变主要在3'单一序列区。Peral等人对3'端的单一序列进行了系统的分析，突变检出率仅为10%～15%，这说明突变主要位于难以进行研究的重复区[5]。
　　最近，人们使用了新的方法对重复区进行了突变检查，发现了许多突变，取得了新的进展。Peral等人采用了一种新的锚定RT-PCR方法来扩增PKD1重复区，这种方法应用了分别们于单拷贝区和重复区的两个引物，对100例患者筛查PKD1基因50%以上的外显子（37%编码区，外显子22～46）其中包括通过应用截断蛋白检测（proteintruncationtest,PTT）筛查11个外显子（22～32），还对其中60例患者用非同位素RNase切割方法检测了外显子23～26的错义突变，其中6处在重复区，包括三处终止突变，三处单核苷酸移码缺失，两处剪接缺陷和三处可能的错义突变[6]。
　　另外，Watnick等人也设计了一种新的方法来对重复区进行检测。他们采用长范围PCR的方法和来自基因的单拷贝区的一个单基因的特异性引物扩增了一个跨越外显子23～34的PKD1特异性模板，这个10kb的模板来自基因组DNA的扩增，可用于利用多种碱基序列的方法进行突变分析。他们用这种方法以及异源双链核酸分子分析对序列变变异体进行了探查，发现几个患者在外显子23和25有几串碱基置换。在两个病人的外显子23内的置换将导致其蛋白的小范围内多个氨基酸的置换。这种成串的碱基置换是不同寻常的。这意味着这个突变是由于PKD1基因的特殊结构造成的[7]。
　　还有，Roefsema等人利用蛋白平截检测的方法减少了由于基因的重复而造成的麻烦，鉴定了7个在重复区的突变。由于新方法和技术的采用，对重复区的突变逐渐被发现并得不到研究，这对于ADPKD的诊断和发病研究有重复意义[8]。
　　对于一个发病率高于千分之一的遗传病，其诊断就显得相当重要。在临床上，B超是诊断的良好手段；在基因诊断方面，这个基因不未克隆之前，就有人利用连锁分析进行基因诊断。虽然现在人们对于突变的研究取得了新的进展，但由于该基因突变种类多，突变机理尚不清楚，现在对于ADPKD的基因诊断最基本的方法还是连锁分析。在PKD1基因的附近存在着许多遗传标记和微卫星DNA，如KG8-CA，SM6，CW2，和CW3等。这些位点都有较高的多态性，可以通过PCR扩增进行连锁分析。最近，Bresin等人发现了一个PKD1基因的多态位点，可用于基因内连锁分析。他们发现，在外显子46内有一个T到C的同义转换多态（12838T→C，Pro4209Pro），这个多态位点在病人和正常人中都存在，通过对89个意大利人的分析，其杂合度为0.347，等位率为0.222。由于这个位点丢失，所以可以通过PCR扩增，限制性内切酶处理来进行基因内连锁分析。这使得分析方法更为简单且结果更为准确[9]。
2PKD1的分子病理研究
　　PKD1基因克隆和其蛋白产物多囊蛋白鉴定后，许多人对该基因的表达和蛋白来细胞定位进行了研究，发现多囊蛋白在上皮细胞中有广泛的存在，在胎儿上皮细胞中该蛋白显著的多于成人，然而在大多数多囊病患者肾的囊泡中有过度的表达[10]。
　　PKD1基因的突变究竟是通过激活还是失活的方式导致肾多囊病的呢？Brasier对此通过染色体16p13的PKD1区域的微卫星标记进行囊泡上皮细胞的杂合性丢失（LOH）分析。他发现来自三个病人的5个囊泡有16p13的LOH，4个囊泡的微卫星标记丢失。在两个病人中，家族成员的微卫星分析分析证实了囊泡内丢失的是野生型PKD1拷贝，对第三个病人3个独立的囊泡进行LOH检测证实丢失的是一个等位基因。结果显示囊泡上皮细胞的克隆化染色体异常是野生型PKD1拷贝丢失。这支持了成人多囊肾病的功能丢失模式，种系的突变灭活了一个PKD1拷贝，体细胞突变或缺失灭活了另一个有功能的野生型拷贝[1]。
　　于是对于多囊肾病的发病机制，有人提出了二次打击理论。该理论认为，由于遗传或其他的原因，使原来的两个正常的等位基因中的一个失活，当另外一个正常的等位基因也因突变而失活时，囊泡就会生长。对于PKD1和PKD2，在已鉴定受累家庭中突变多表现为基因失活，人和动物模型的囊性肾中有大量的基因表达，这表明与信号传递、转录调节和细胞周期调控相关的细胞过程参与了囊泡的形成，细胞的PKD基因缺损直接影响了上皮细胞的分化调节[12]。
　　成人多囊肾病一般在30到40岁左右发病，然而据统计有大约2%的PKD1基因携带者在儿童时期就有严重的临床症状。Peral发现一个家族，其PKD1基因发生了一个终止突变，Tyr3818Stop，父亲是一个典型的成年发病的患者，已经有了严重的临床症状，异卵双生子，其中一个是突变的携带者，还没有临床症状，但是，另外一个却在儿童时期发病。同一种突变却有不同的严重性，这个家庭的表型多样性不能归结于动态突变。他认为，许多小的修饰因子可能很大地影响疾病的进程。
　　对于成人多囊肾病的发病原因，Hjelle等人提出了一个新的观点。他们认为成人多囊肾病可能是该人类亚群的感染性疾病。用对鲎鱼阿米巴状细胞自溶（theLimulusamebocytelysate,LAL）差别激活检验发现在PKD病人的肾囊泡中有细菌内毒素和真菌1，3-β-D-葡萄糖。囊泡液体的脂酸分析确证有内毒素特征的3-羟基-脂酸存在。PKD病人的组织和囊泡液体中检查到了真菌组份，血清学检查发现有镰刀菌、曲霉菌、制念珠菌的抗原，镰九菌和制念珠菌的IgE，但没有IgG，并且检查到了真菌的DNA，而在正常人中没有发现。于是他们提出了囊泡的微生物激发假说[13]。
3PKD2的进展
　　PKD2位于4号染色体的q21-q23，并且进行了连锁分析来诊断。Schneider等人报道了一个cDNA序列编码一个蛋白，这个蛋白他们戏称为多囊蛋白兄弟，于多囊蛋白C末端氨基酸3688～4109有21%的相同和46%的相似。通过Northern分析，这个基因在包括成人和胎儿的肾在内的各种组织内有广泛的表达。染色体原位杂交分析这个新基因位于4q22，因此他们认为这是PKD2的侯选基因[14]。
　　PKD2定位克隆后，发现它有15个外显子，转录起始点在外显子1内。它的拼接点受体和供体符合GT/AG规则。该基因的蛋白产物为一内在膜蛋白，有968个氨基酸，6个穿膜区，与PKD1的蛋白产物和电压激活Ca离子通道有相似性，它有一个潜在的Ca结合域[15，16]。
　　最近，Tsiokas等人证实了PKD1蛋白和PKD2蛋白之间有相互作用，它们的细胞质内C-端尾巴相互作用导致PKD1的上调。而且，PKD2的胞质内尾巴可以通过一个绕环结构域形成同源二聚体，这个结构域正是于PKD1相互作用的部分。这意味着PKD1和PKD2可能是通过同一个信号途径来发挥功能的。这个途径对于肾小管的形成是必须的，而PKD1的稳定表达需要PKD2的存在[17，18]。
　　由于P基因相对于PKD1基因进行突变分析比较容易，所以它一得到克隆就发现了不少的突变。Veldhuisen等人对35个家庭采用单链构象多态（SSCP）对该基因进行了系统的突变分析，发现了20个突变。这些突变包括小的缺失，插入，导致翻译提前终止的转换，另外政治家氨基酸转换，剪切位点的突变。这些突变都不相同，分布在整个基因中，没有成串现象。Viribay等人对4号染色体连锁的ADPKD家庭采用异源双链核酸分子和SSCP进行分析，发现了7个突变，检出率为90%。这些突变都导致翻译的提前成熟：4个终止突变，3个移码缺失；而且，所有突变也是互不相同，分布于整个基因。这些发现形式表明，在PKD2患者的囊泡形成的第一步是PKD2有功能的拷贝的丢失[17，18]。
　　Wu等人克隆了小鼠的PKD2同源基因，被克隆的cDNA序列有5134bp，编码一个有966个氨基酸的膜内在蛋白，与人PKD2基因一样有6个穿膜区。人与小鼠之间PKD2基因在氨基酸水平上有91%的相同，98%的相似。小鼠PKD2基因定位于5号染色体，被认为是突变导致小鼠多囊肾病的特定基因[19]。
随着PKD基因被克隆测序，关于ADPKD的研究正在广泛的开展，相信不久人们对这个发病率极高的遗传病的发病机理会有更深刻的理解，对于这个病的预防和治疗有更进一步的发展。