胶乳凝集试验检测O1群霍乱弧菌

LatexagglutinationtestfordetectionV.choleraeserotypeO1

CHENGZhaopeng,ZHOUJifen,SHANYongmei,etal

　　（GanQuanHospital,AffiliatedtoMedicalCollegeofShanghaiRailwayUniversity,Shanghai200065）

　　Abstract　TodevelopeasimpleandrapidmethodfordetectingV.choleraeO1,latexparticesweresensitivedwithanti-V.choleraeO1monoclonalantibodies,andalatexagglutinationtest（LAT）detctingV.choleraeO1in6-hfecalenrichmencultureswasdeveloped.ThedetectionlimitofLATwas5×105CFU/ml,anddetecttimewaslessthan5min.OF92faecalsamplefromclinicallysuspectedcasesofcholera,44wereidentifiedasV.choleraeO1byculturemethodsandalsogavepositiveresultsintheLAT；48werenegativebyculturemethodsbut1gavefalsepositiveintheLAT.Thisfalsepositiveonecanbeidentifiedbythemicrosopy.

　　Keywords　latexfixationtest；　VibroCholerae

　　霍乱是一种烈性肠道传染病,其早期诊断有利于及时治疗和传染源隔离。本文报道一种快速检测O1群霍乱弧菌的胶乳凝集试验（LAT）,标本增菌6小时即可进行检测,LAT操作时间不足5min。

　　1　材料和方法

　　1.1　试剂　抗O1群霍乱弧菌多价单克隆抗体由上海市卫生防疫站提供；羧化聚苯乙烯胶乳（0.8μm）由上海市临检中心提供；SPA-Sepharose4B购自Sigma公司。

　　1.2　标本　疑似霍乱粪便标本92例,取自1994年7～9月间就诊的腹泻病人,接种碱性蛋白胨水37℃增菌6h后转种TCBS平板进一步鉴定。所剩碱性胨水培养物隔水煮沸灭菌,－30℃冻存。临用前室温融化,旋涡混匀。阳性对照由上海市普陀区卫生防疫站提供,其菌液浓度为1.3×108CFU/ml。阴性对照为大肠埃希菌菌落混悬于碱性蛋白胨水中。107例其它肠道杆菌标本由本科和上海市长宁区中心医院检验科提供。

　　1.3　单克隆抗体纯化　按文献［1］方法进行。1.5gSPA-Sepharose4B用10.0mlpH8.00.01mol/LPBS溶胀、装柱。2.0ml单克隆抗体用PBS1∶4稀释后上样，关紧出水口，4℃2h。PBS冲洗后用pH4.00.1mol/L柠檬酸-磷酸盐缓冲液解析。收集解析液中含抗体活性管用pH9.01.0mol/LTris-HCl中和，置透析袋中PEG-20000浓缩，pH7.20.02mol/LPB充分透析，测蛋白浓度。柱用pH3.00.1mol/L柠檬酸-磷酸盐缓冲液再生。

　　1.4　免疫胶乳制备　按文献［2］方法进行。2.5ml100g/L羧化胶乳中加2.5ml0.02mol/L正氨基已酸和5.0mlpH7.20.2mol/LPB。加50mg碳化二亚胺，室温搅拌1h，用PB离心洗涤后配成25g/L浓度。取1.0ml此胶乳中加入一定量的纯化抗体及7.5mg碳化二亚胺，37℃搅拌2h。加100μlpH8.40.1mol/L甘氨酸缓冲液，30min后用PB离心洗涤两次，用含1g/LNaN3的PB配成10g/L胶乳悬液，4℃存放。

　　1.5　胶乳凝集试验　在黑色玻璃反应板小方格内，各加1滴（约50μl）增菌6h的碱性蛋白胨水和免疫胶乳试剂，轻轻摇动，5min内观察结果。出现清晰、均匀一致的凝集颗粒者为阳性，反之为阴性。每次试验均设阴、阳性对照。

　　2　结果

　　2.1　LAT的敏感性　阳性对照用碱性蛋白胨水倍比稀释到5×105CFU/ml时仍出现清晰的凝集颗粒。

　　2.2　LAT的特异性　107例其它肠道杆菌标本，其中副溶血性弧菌15例，非O1群霍乱弧菌20例，温和气单胞菌15例，亲水气单胞菌10例，类志贺邻单胞菌8例，伤寒沙门菌14例，志贺菌20例（福氏16例，宋内4例），普通变形杆菌5例。各取一定量的菌落（或菌苔）于碱性蛋白胨水中制成悬液，进行LAT检测。结果均为阴性。

　　2.3　重复性和稳定性　将致敏胶乳保存于4℃冰箱，对5×105CFU/ml菌液浓度的阳性对照和特异性试验中的副溶血性弧菌、非O1群霍乱弧菌、温和气单胞菌、伤寒沙门菌各10例每两周测定1次，三个月内共测定6次，结果相同。致敏胶乳一年内对阳性对照测定的敏感性不变。

　　2.4　与培养法结果的比较　92例临床标本，培养法阳性44例，均为El-tor生物型小川血清型霍乱弧菌，LAT检测均阳性；培养法阴性48例，LAT检测47例阴性，1例阳性。此例LAT检测时呈大小不一的凝块，经进一步鉴定为酵母菌。

　　3　讨论