腓骨肌萎缩症患者致病基因突变特点的研究

时间 : 2009-12-06 11:39:00 来源：zhangcheng.54doctor.net

[摘要]

腓骨肌萎缩症患者致病基因突变特点的研究--广州中山医科大学附属第一医院神经内科―张成医生个人网站

腓骨肌萎缩症患者致病基因突变特点的研究张成-BY-2006-5-2215:12:00

张付峰唐北沙赵国华罗巍夏昆刘小民肖剑锋张如旭陈彪张成潘乾蔡芳郭鹏摘要：目的探讨腓骨肌萎缩症（Charcot-Marie-Toothdisease，CMT）致病基因的突变特点。方法应用实时荧光定量PCR方法、聚合酶链反应-单链构象多态性分析（PCR-SSCP）或PCR直接测序等方法对113个确诊的CMT家系进行了PMP22、MPZ、CX32、EGR2、GDAP1、NEFL、HSP22、HSP27等致病基因进行突变检测。结果发现有36个家系为PMP22重复突变所致，7个家系为CX32基因突变所致，1个家系为MPZ基因突变所致，1个家系为GDAP1基因突变所致，1个家系为HSP22基因突变所致，1个家系为HSP27基因突变所致，未发现PMP22、EGR2和NEFL基因点突变。结论CMT的PMP22基因重复突变所占比例为31.9%，CX32基因突变所占比例为6.2%，HSP22、HSP27、MPZ和GDAP1基因点突变所占比例均为0.9%，PMP22、EGR2和NEFL基因点突变少见。

ThecharacteristicsofgenemutationsinChinesepatientswithCharcot-Marie-Toothdisease.ZHANGFu-feng*，TANGBei-sha，ZHAOGuo-hua，LUOWei，XIAKun，LIUXiao-min，XIAOJian-feng，ZHANGRu-xu，CHENBiao，HANGCheng，PANQian，CAIFang，GUOPeng.*DepartmentofNeurology，XiangyaHospital，CentralSouthUniversity，Changsha，Hunan，410008China.Correspondingauthor：TangBei-sha，Email：bstang7398Uyahoo.Vom.Vn【Abstract】ObjectiveTostudythecharacteristicsofgenemutationsinChinesepatientswithCharcot-Marie-Toothdisease（CMT）.MethodsReal-timequantitativePCR，PCR-SSCP，and/ordirectsequencingwereusedtoanalyzethemutationofthepathogenicgenesPMP22，MPZ，CX32，EGR2，GDAP1，NEFL，HSP22andHSP27in113probandsofCMTfamilies，45ofwhichhadfamilyhistory，fromdifferentprovincesinChina.Thewholefamilymembersofthesubjectswithabnormalelectrophoreticbandsand50normalcontrolsunderwentthesameexamination.ResultsThirty-sixcasesofPMP22duplication，7casesofCX32mutation，1caseofHSP22mutation，1caseofHSP27mutation，1caseofMPZmutation，and1caseofGDAP1mutationwerefoundinthe113CMTprobands.NopointmutationwasfoundinPMP22，EGR2andNEFLgenes.ConclusionAmongtheChineseCMTpatients31.9%arecausedbyPMP22duplication，6.2%byCX32，and0.9%byHSP22，HSP27，MPZandGDAP1.PointmutationsofPMP22，EGR2andNEFLarerare.

腓骨肌萎缩症（Charcot-Marie-Toothdisease，CMT）是一类最常见的遗传性周围神经病，具有明显的临床和遗传异质性，发病率约为1/2500。多数呈常染色体显性遗传（AD），也可呈常染色体隐性遗传（AR）及X连锁显性（XD）或隐性遗传（XR）。临床上依据其病理和电生理特征可分为两型：脱髓鞘型（CMT1型），轴突型（CMT2型）。目前，腓骨肌萎缩症已定位36个亚型，其中26个亚型的疾病基因已被克隆。为开展CMT基因诊断的研究和明确中国人CMT患者致病基因的突变特点，我们应用实时荧光定量PCR、聚合酶链反应、聚合酶链反应-单链构象多态性分析（PCR-SSCP）或PCR直接测序等方法对113个确诊的CMT家系进行了PMP22、MPZ、CX32、EGR2、GDAP1、NEFL、HSP22、HSP27等致病基因进行了突变检测。

对象与方法一、对象113个CMT家系先证者为湘雅医院神经内科和中国医学遗传学国家重点实验室的中国遗传病资源保藏中心、首都医科大学北京宣武医院神经内科、中山大学第一附属医院神经内科所收集的病例，均A：正常对照；B：存在PMP22基因重复的CMT1A患者，PMP22基因的起始拷贝数增加，使得扩增曲线左移图1PMP22基因和ALB基因的扩增曲线图为汉族，其中男72例，女28例，起病年龄1～48岁，诊断标准参见文献［1］。113个家系分别来自湖南、北京、广东、山东、湖北、海南和安徽等省市。其中45个家系有家族史，约占家系的38.5%。二、方法1.MP22基因大片段重复突变的检测方法：采用实时荧光定量PCR和TaqMan探针，ALB基因作内对照，引物和探针设计参考文献［2］，对每个家系先证者进行检测。每个样本进行PMP22基因、ALB基因扩增时均做3次重复，反应在ABIPrism7000荧光定量PCR仪上进行。PMP22基因与ALB基因的起始拷贝数之比，作为PMP22基因的相对表达量，用于分析。应用ΔΔCt法，与内对照ALB基因比较可以得出PMP22基因的相对拷贝数，ΔCt是代表每个样本3次重复的平均Ct值，ΔΔCt=［ΔCtALB（正常对照样本）-ΔCtPMP22（正常对照样本）］-［ΔCtALB（检测样本）-ΔCtPMP22（检测样本）］，PMP22基因的相对拷贝数等于2-（ΔΔCt+/-s），S代表PMP22基因和ALB基因Ct值的平均标准差［3］。2.PMP22、CX32、MPZ、EGR、GDAP1、NEFL、HSP22和HSP27基因点突变的检测方法：PMP22、CX32、MPZ、EGR、GDAP1和NEFL基因采用PCR-SSCP方法进行检测，引物设计参考文献［4-6］，所有先证者均进行检测。有异常泳带者取家系全部成员重复2次，并同时检测50名正常对照，排除多态后，按常规方法回收纯化模板，正反向测序2次。测序结果经基因突变数据库对比分析。HSP22和HSP27基因采用DNA序列分析的方法，HSP22设计3对引物（表1），HSP27设计4对引物（表2），所有先证者均进行PCR扩增，将PCR产物用虾碱性磷酸酶（phosphatasealkaline，shrimp）和核酸外切酶（exonucleaseⅠ）进行酶切，酶切产物经ABIPRISM3100自动测序仪正反向测序，测序结果分别与人类基因组HSP22和HSP27基因序列比较，使用DNASTAR软件分析结果。表1用于扩增HSP22基因外显子的PCR引物序列外显子引物序列扩增片段长度（bp）1GGCAGGTGGTTCTGTCTCTC517AACGTCAGCTCCCAGGAAA2GGATGCCCAAGGAACATAGA200AAGAGGGAGAGACCCCAGAT3TTCCCAAGACCACACAGCTA386CCTGGAATCAGAGAAGCCCTA表2用于扩增HSP27基因外显子的PCR引物序列外显子引物序列扩增片段长度（bp）1-1CCGACTGGAGGAGCATAAAA398GGGCGAAGTGGTTGACAT1-2GAGTGGTCGCAGTGGTTAGG395CTGAGCAAGGGAATCAGGAG2CCAACCCCCTCTGTTAATCC300GAGGAAAGGCAAGCGTTACA3ACGAGCATGGCTACATCTCC476GTGACAGGTGGTTGCTTTGA

结果一、实时荧光定量PCR正常对照gDNA的PMP22基因和ALB基因3次重复PCR扩增曲线基本重合，Ct值基本相同（图1A）。

PMP22基因重复突变的患者PMP22基因的PCR扩增曲线较ALB基因的PCR扩增曲线左移，PMP22基因的Ct值比ALB基因的Ct值低（图1B）。113例CMT患者中有36例发现为PMP22基因重复突变（31.9%），PMP22基因起始拷贝数/球蛋白基因起始拷贝数值波动于1.50～2.26之间，而50名正常对照均未发现存在PMP22基因的重复或缺失，PMP22基因起始拷贝数/球蛋白基因起始拷贝数值波动于0.83～1.25之间（表3）。表3应用实时荧光定量PCR检测CMT患者的PMP22基因拷贝数组别例数PMP22基因起始拷贝数/ALB基因起始拷贝数比例2-ΔΔCt2-ΔΔCt低值2-ΔΔCt高值对照组500.83～1.250.781.30CMT1A组361.50～2.261.402.42二、PCR-SSCP检测CX32、MPZ、GDAP1、PMP22、NEFL、EGR2基因各发现9、3、3、2、1、1个家系有异常条带，排除多态后仍有异常的家系分别有7、1、1、0、0、0个［4-6］。三、DNA序列分析结果HSP22基因DNA序列分析发现1家系在HSP22基因外显子2发生了423G→T碱基改变（图2），使得所编码的氨基酸发生了Lys141Asn改变，该突变与疾病表型共分离（图3）。HSP27基因DNA序列分析发现1家系在HSP27基因外显子2发生了379C→T碱基改变（图4），使得所编码的氨基酸发生了Arg127Trp改变，该突变与疾病表型共分离。

讨论CMT是一大类临床和遗传异质性均很明显的周围神经病，尽管CMT基因分型目前至少有36个亚型，但国外报道CMT1型占AD遗传的70%和散发病例的90%都是由包含PMP22基因在内的1.5Mb的大片段重复突变所致。实时荧光定量PCR在检测基因大片段重复或缺失中，是一种简便、灵敏、快速、重复性好的诊断方法［2］。本研究结果提示我国CMT患者中由PMP22重复突变所致的CMT1A占31.9%，比国外报道明显偏低［7］。这可能是我国CMT的发病机制在分子水平上与国外存在一定的差异。X连锁遗传的CMT患者大部分为Cx32基因突变所致，但由于X连锁遗传的CMT在整个CMT中相对少见，国外资料显示，由Cx32基因突变所致的CMT占5.4%［8］。本研究结果比国外报道偏高［4，8-10］。MPZ基因突变既可以引起CMT1型，又可以引起CMT2型，国外报道由MPZ基因突变所致的CMT占0.7%［8］，本研究结果与国外报道基本一致。GDAP1基因突变是导致常染色体隐性遗传CMT最常见的基因。我们在8个隐性遗传的CMT家系和15个散发CMT患者中做了此基因的突变检测，结果发现1个家系为GDAP1基因突变所致［6］。CMT1型很少一部分患者为PMP22基因点突变所致。我们在本组家系中并未发现PMP22基因点突变，可能我国CMT患者由PMP22基因点突变所致的非常少见。NEFL基因突变与CMT2E的发病有关，NEFL基因编码1个由543个氨基酸组成的神经丝轻链蛋白，其对轴突的结构和功能非常重要，尤其是对较大一点的轴突，他们可能在有效转运、轴突再生和轴突的寿命方面发挥重要作用。由于神经丝蛋白是轴突病理上重要的靶位点，而CMT主要病变是神经元的髓鞘和轴突，因此，其相应的基因可以当作CMT致病基因的候选基因。我们并未检测到NEFL基因突变，提示我国CMT2E患者少见［5］。EGR2基因突变与CMT1D的发病有关。由于Egr基因剔除小鼠纯合子（Egr-/-）表现有周围神经的少髓鞘，而且有雪旺细胞在分化早期被阻断导致后期的髓鞘蛋白（MBP、MPZ基因）表达减少或缺失等现象，Warner等［11］将EGR2基因作为遗传性周围神经病的候选基因。我们未检测到EGR2基因突变，提示我国CMT1D患者少见。我们将一新型的CMT2型家系定位于12q24，命名为CMT2L型［12］。最近我们在此家系内发现热休克蛋白22（smallheat-shock22-kDaprotein，HSP22或HSPB8）基因第2号外显子存在一种错义突变K141N（图2），该突变与疾病表型共分离，家系外200名正常人未检测到此突变，证实了HSP22位CMT2L型的致病基因。本结果未发现其他家系也存在HSP22基因突变，说明HSP22基因突变在我国CMT患者中少见。最近，Evgrafov等［13］在2个CMT2F家系内发现了HSP27基因突变，并证实了HSP27就是CMT2F的致病基因。本研究结果说明我国也存在CMT2F患者，但比较少见。

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