β内酰胺类抗生素对产ESBL肺炎克雷伯菌小鼠肺炎疗效研究

作者：裴迎华张杰马越李景云

【摘要】目的评价几种β内酰胺类抗生素对不同的产超广谱β内酰胺酶（ESBL）肺炎克雷伯菌动物肺炎模型的疗效。方法选择临床分离的2株对实验用抗生素敏感的产ESBL肺炎克雷伯菌建立小鼠肺炎模型。根据细菌分为GX6998和Tian29两组，于感染后6h给药。对照组腹腔注射生理盐水0.5ml；治疗组分别给予头孢哌酮/舒巴坦、头孢他啶、头孢吡肟和哌拉西林/三唑巴坦。连续治疗72h后，根据细菌计数结果评价疗效。结果体外药敏试验表明Tian29对4种抗生素的MIC值均大于GX6998，但仍在敏感范围内。4种抗生素治疗后，各组病死率均显著减低。GX6998组中4种抗生素均可显著降低肺组织匀浆的细菌计数（P<0.01）。Tian29组中头孢哌酮/舒巴坦、头孢他啶可以显著降低肺组织匀浆的细菌计数（P<0.05）；头孢吡肟和哌拉西林/三唑巴坦也可使组织匀浆的细菌计数减少，但与对照组比较差异无显著性（P>0.05）。比较同一种抗生素对2株细菌的清除作用发现，4种抗生素对GX6998的清除作用均强于Tian29（P<0.01）。结论体外敏感的广谱β内酰胺类抗生素和β内酰胺酶抑制剂复合制剂治疗产ESBL肺炎克雷伯菌感染均可显著降低动物模型的死亡率，减少肺组织匀浆细菌计数。但如果细菌对抗生素的MIC升高，将会影响治疗效果。

【关键词】超广谱β内酰胺酶；β内酰胺类抗生素；肺炎克雷伯菌；药效学

ABSTRACTObjectiveToevaluatetheefficacyofseveralβlactamsagainstESBLproducingKlebsiellapneumoniaepneumoniainamousemodelofpeneumonia.MethodsTwoclinicalKlebsiellapneumoniaestrainssusceptibletotheexperimentalantimicrobialagents,KlebsiellapneumoniaeGX6998andTian29,weredividedintotwogroupsformousepneumoniainfectionrespectively.Aftersixhourinfection,micewereintraperitoneallyinjectedwith0.5ml0.9%NaClforcontrol;micewereintraperitoneallyinjectedwithceftazidime,cefepime,cefoprazoneplussulbactamandpiperacillinplustazobactamrespectivelyfortrial.Seventytwohourslater,therapyefficacieswereevaluatedwithbacterialcounts.ResultsAllthetrialgroupshadsignificantlylowermortalitythancontrolgroups（P<0.05）.Comparedwiththecontrolgroups,inGX6998infectedgroups,thebacterialamountswithallthetestingagentsweresignificantlydecreased（P<0.01）;inTian29infectedgroup,thebacterialamountswithcefoprazoneplussulbactamandceftazidimeweresignificantlydecreased（P<0.05）;incefepimeandpiperacillinplustazobactamgroups,bacterialamountswerereducedwithoutsignificantdifferencewiththatofthecontrolgroup（P>0.05）.ConclusionThecombinationsofbroadspectrumβlactamsandβlactamasesinhibitorcouldreducethemortalityandbacterialamountsinmousepneumoniamodelwhichweresusceptibletoESBLsproducingKlebsiellapneumoniastrains.However,theclinicalefficacywouldbereducedwhentheMICincreased.

KEYWORDSExtendedspectrumβlactamases;βLactamsKlebsiellapneumonia;Pharmacodynamics

肺炎克雷伯菌是院内下呼吸道感染的主要致病菌。我国院内感染的肺炎克雷伯菌43%为产超广谱β内酰胺酶（ESBL）菌株［1］。感染产ESBLs肺炎克雷伯菌患者的预后明显较感染不产ESBLs肺炎克雷伯菌患者差［2］，能否使用广谱β内酰胺类抗生素治疗此类感染一直存在争议。本研究通过小鼠肺炎模型评价几种临床常用的广谱β内酰胺类抗生素和酶抑制剂复合制剂对产ESBLs肺炎克雷伯菌动物肺炎的疗效。

1材料与方法

（1）观察药品头孢他啶（GlaxoSmithkline公司，批号C076348，纯度89.4%）；头孢吡肟（BristalMyersSquibb公司，批号0505793，纯度88.6%）；头孢哌酮/舒巴坦（Pfizer公司，批号45839147，纯度96.6%）；哌拉西林/三唑巴坦（Wyeth公司，批号A56167，纯度88.6%）。

1.2实验菌株

使用临床分离的产ESBLs肺炎克雷伯菌GX6998和Tian29建立肺炎模型，菌株来自国家食品药品监督管理局细菌耐药性监测中心。ESBLs表型确证试验按CLSI/NCCLS（2002年）标准纸片扩散法操作。

1.3实验动物

雄性昆明种小白鼠，体重（25±2）g，购自中国医学科学院动物研究所。

1.4产ESBL肺炎克雷伯菌最小抑菌浓度（MIC）测定

细菌MIC的测定采用CLSI/NCCLS（2002年）推荐的微量肉汤稀释法，使用大肠埃希菌ATCC25922和肺炎克雷伯菌ATCC700603作为质控菌［3］。

1.5建立肺炎模型

将菌株密集划线于MH培养基上，37℃恒温箱培养18h后用生理盐水冲洗菌苔，菌悬液用生理盐水稀释到5×1010CFU/ml，取30μl（1.5×108CFU）用于制备肺炎模型。

实验小鼠称重后腹腔注射10%水合氯醛（0.4ml/g）麻醉，自颈部正中切开皮肤，钝性分离直至暴露气管。用1ml注射器将30μl菌悬液经气管缓慢注入后将小鼠直立摇晃3min，使细菌尽量均匀分布于两肺。

1.6动物分组及给药方案

将小鼠随机分为两组，分别接种肺炎克雷伯菌GX6998和Tian29。两组内再根据治疗措施不同分为对照组和头孢哌酮/舒巴坦、头孢他啶、头孢吡肟和哌拉西林/三唑巴坦4个抗生素组。治疗开始于接种细菌后6h，对照组每8h腹腔注射生理盐水0.5ml；4个抗生素组分别每8h腹腔注射头孢哌酮/舒巴坦200mg/kg、头孢他啶200mg/kg、头孢吡肟200mg/kg，每6h腹腔注射哌拉西林/三唑巴坦120mg/kg，以上方案连续应用3d后统计各组的病死率。之前的药动学实验表明，此给药方案可以保证4种抗生素的血清药物浓度大于肺炎克雷伯菌GX6998MIC值的时间超过给药间隔的40%。

1.7细菌计数测定

各组分别于治疗前及治疗后24、48和72h（最后一次给药后4h）各时间点将小鼠处死后充分放血，取双肺，冰生理盐水冲洗3次，置于玻璃匀浆器中加入2ml生理盐水研磨15min，制成肺组织匀浆。10倍倍比稀释肺组织匀浆，依次取各浓度100μl接种于MH琼脂培养基上，35℃恒温孵育18h，选取菌落在30～300个之间的平板进行菌落计数。

1.8统计学分析

采用SPSS11.5统计软件包进行统计分析，计量资料以均数±标准差表示，两组间均数比较采用t检验，多组间均数比较采用方差分析，组间两两比较应用q检验，计数资料采用卡方检验，P<0.05认为有显著性差异。

2.1MIC测定结果

Tian29对4种抗生素的MIC值均大于GX6998，但仍在敏感范围内（表1）。

2.2病死率比较

两组中，头孢哌酮/舒巴坦、头孢他啶、头孢吡肟以表12株细菌对4种抗生素的MIC值（mg/L）以头孢哌酮的标准判读此结果。

及哌拉西林/三唑巴坦治疗后与对照组比较病死率显著降低。各抗生素组间病死率比较无显著差异（表2）。

2.3细菌计数结果

（1）4种抗生素对GX6998感染的疗效比较治疗72h后，4种抗生素都可以显著降低肺组织的细菌量（P<0.01）；治疗前后细菌计数的差值与对照组比较均有显著性差异（P<0.01）；各抗生素组间比较无显著性差异（表3）。表24种抗生素治疗2株细菌感染的病死率比较表34种抗生素对GX6998杀菌作用比较*：与治疗前比较P<0.01；**：与对照组比较P<0.01。

（2）4种抗生素对Tian29感染的疗效比较治疗72h后，头孢哌酮/舒巴坦和头孢他啶可显著降低肺组织的细菌量，治疗前、后细菌计数的差值与对照组比较有显著性差异（P<0.05）；头孢吡肟和哌拉西林/三唑巴坦治疗72h后细菌计数有所减少，但和治疗前比较无显著性差异，治疗前、后细菌计数的差值与对照组比较也无显著性差异（表4）。

（3）同一抗生素对2株细菌感染的疗效比较比较两组中每一种抗生素治疗前后肺组织细菌计数的差值发现，4种抗生素对GX6998的清除作用均强于Tian29（表5）。表4比较4种抗生素对Tian29杀菌作用表5比较4种抗生素对2株菌的杀菌作用

本研究通过观察4种临床常用的广谱β内酰胺类抗生素治疗产ESBLs肺炎克雷伯菌导致的小鼠肺炎，发现4种抗生素均对MIC值较低的细菌GX6998清除作用较好；对细菌Tian29清除作用较差，即使Tian29对这些抗生素也敏感，提示即使广谱β内酰胺类抗生素对产ESBLs肺炎克雷伯菌敏感，随着MIC值的升高其治疗效果也会逐渐减弱。

广谱β内酰胺类抗生素因为对产β内酰胺酶和广谱β内酰胺酶的革兰阴性菌治疗效果良好，一直被广泛应用于临床。研究发现，广谱β内酰胺类抗生素治疗敏感的产ESBLs细菌感染往往不能达到预期的效果，其治愈率和生存率明显低于碳青霉烯类、头霉素类、氟喹诺酮类和氨基糖苷类抗菌药物，所以不建议用于治疗产ESBLs细菌导致的感染［4］。

目前认为β内酰胺抗生素治疗产ESBLs细菌感染失败的主要原因之一是接种量效应。肠杆菌科细菌对所有的β内酰胺类抗生素均有不同程度的接种量效应，其中头孢吡肟最明显［5］。但是接种量效应并不能说明使用β内酰胺类抗生素治疗一定无效。Maglio等［6］在实验中选择了多株产ESBLs大肠埃希菌建立动物感染模型，虽然体外实验也表现明显的接种量效应，但体内实验发现感染部位105和107CFU/ml细菌量对于头孢吡肟的治疗效果并没有影响。ThanvinEliopoulos等用哌拉西林/三唑巴坦和头孢吡肟治疗产ESBL的肺炎克雷伯菌大鼠腹腔脓肿模型，也得到相同的结果［7］。两项研究均表明，血清药物浓度大于药物对细菌的MIC的时间（%T>MIC）是判断β内酰胺类抗生素抗感染疗效的有效指标。