扶正化瘀方促进二甲基亚硝胺肝纤维化大鼠肝窦毛细血管化逆转作

扶正化瘀方促进二甲基亚硝胺肝纤维化大鼠肝窦毛细血管化逆转作

用的实验研究

陆雄刘平刘成海徐光福李风华顾宏图刘成

[摘要]目的：探讨临床有效的抗肝纤维化扶正化瘀319方（下称319方）对肝纤维化、肝硬化常见病理变化肝窦毛细血管化的逆转作用。方法：采用二甲基亚硝胺（DMN）4周12次腹腔注射制备大鼠肝纤维化模型。造模成型后分为模型对照组与319方治疗组，用药4周；获取血清与肝组织，作病理组织学、电镜超微结构、免疫组化、肝组织羟脯氨酸含量及肝功能测定。结果：正常组大鼠肝窦内皮细胞外周胞浆很薄，有许多小窗孔，内皮下末见基底膜。模型组大鼠肝窦扭曲、狭窄，内皮细胞胞浆窗孔减少成消失，有明显的基底膜出现：肝组织可见出血性坏死，门脉区大量的结缔组织增生，纤维间隔向小时内伸展，肝组织Hyp含量显著增高；肝窦壁Ⅷ因子相关抗原、α-SMA、LM及IV型胶原阳性染色较正常大鼠均显著增强，且范围较广。与模型对照相比较，319方治疗组肝窦扭曲、狭窄程度及内皮窗孔减少和消失程度轻，基底膜较薄成不连续，部分肝窦结构接近正常；肝细胞变性坏死程度轻，肝组织内纤维间隔明显减少，Hyp含量显著降低（P<0.05）；肝窦壁Ⅷ因子相关抗原、α-SMA、LM及Ⅳ型胶原阳性染色均显著减弱，分布面积图像分析结果均显著降低（P<0.05）。结论：扶正化瘀319方可显著促进肝纤维化、肝硬化常见病理变化肝窦毛细血管化的逆转。

1、材料319方流浸膏，上海中医药大学肝病研究所制备，含生药0.369g/ml。小鼠抗人Ⅳ型胶原蛋白单克隆抗体，兔抗小鼠层粘连蛋白（LM）多克隆抗体，SIGMA公司产品；兔抗人第Ⅷ因子相关抗原（vWF）多克隆即用型抗体及阴性对照试剂，日本大阪市立大学山本博士惠赠；小鼠抗人α-SMA单克隆抗体，DAKO公司产品；

2．1动物造模及处理：大鼠36只，体重约150g，随机取7只为正常组，余29只大鼠进行造模，造模前按每DMN335µ1加10.15MNaC1稀释至66.96ml的比例配成稀释液备用，每天1次，每次给大鼠腹腔注射上述DMN稀释液2ml/kg，每周连续3天，共4周。大鼠经4周造模完成后，随机分成2组，模型对照相（以下称模型组，13只）、319方治疗组（16只），319方以65kg成人体重剂量的10倍量灌胃，正常和模型组分别灌与中药等量的生理盐水，用药4周。

2．2取材及组织处理：大鼠在称量并记录体重后，乙醚麻醉下开腹，观察腹水的有无，经下腔静脉采血，分离血清；迅即摘取肝脏、脾脏称重，立即取1.0cm×0.8cm×0.3cm大小肝组织，10%中性福尔马林液中固定，24小时后逐级酒精脱水，二甲苯透明，56℃石蜡包埋，切片用于HE、胶原和免疫组化染色；另每组取3只动物，切取1mm3大小肝组织数小块，于2.5%戊二醛磷酸缓冲固定液中固定2h，经0.1M二甲砷酸钠缓冲液（PH7.4）冲洗后入1%锇酸磷酸缓冲固定液中后固定2h，饱和醋酸铀块染。常规脱水，环氧树脂618包埋，半薄切片定位，超薄切片，柠檬酸铅染色，H-600透射电镜观察标本备用。取部分肝组织-70℃保存，检测羟脯氨酸含量。

2．3血清丙氨酸氨基转移酶活性，赖氏法：血清白蛋白（A1b）含量，溴甲酚绿法：总胆红素含量，卫生部临床检验中心推荐方法（J-P）法，均采用卫生部上海生物制品研究所生产的试剂盒测定。血清透明质酸（HA）含量测定，采用上海海军医学研究所生产的试剂盒测定。

2．4肝组织轻羟脯氨酸（Hyp）含量测定：用Jamall氏法。

2．5肝组织胶原纤维染色（丽春红染色）：石蜡切片常规脱蜡至水→0.5%丽春红，苦味酸染液2分种→纯酒精分化2分钟→脱水、透明，中性树胶封固。胶原纤维增生程度半定量标准：0级：正常肝脏，无明显胶原纤维增生；1级：胶原纤维增生，中央静脉和门脉区有少量星状胶原纤维束放散，但无间隔形成；2级：胶原纤维增生，中央静脉和门脉区结缔组织变厚，由此向四周伸出纤维索，形成不完全间隔；3级：原纤维大量增生，有个别菲薄的完全间隔形成；或较厚的不完全间隔即将形成假小叶；4级：完全间隔较厚，假小叶大量形成。

2．6免疫组化染色：envision试剂两步法。参照文献，制定肝窦壁免疫组化半定量判断标准。0级，阴性；1级，微弱，可疑阳性；2级，弱，少量散在，高倍镜下明确阳性：3级，中等，低陪镜下明确阳性；4级，强，阳性灶分布广泛；5级，很强，阳性灶连结成片，着色强烈。采用HPLAS-1000高清晰度彩色病理图文分析系统。免疫组化染色切片每组各取3张，随机选择3个不同视野，在20×10放大倍数下，测定标准初量窗口（7.04E+004）中肝窦壁阳性区域的面积比。

2．7统计学方法：计量资料用计算机统计SPSS10.0中ANOVA程序进行单因素方差分析，并用LSD法进行两两比较；计数资料用Ridit分析法。

3．1各组大鼠肝脏大体观察及大鼠腹水率、死亡率情况比较：

大鼠在造模过程中，体重增长明显抑制，停止造模分组治疗后，各组体重均有增加，但无统计学差异。肝/体重指数方面，三组相比皆无显著差异。脾/体重指数方面，模型组及319方组均显著高于正常组。从死亡情况看，模型组及319组均有2只大鼠死亡。模型组及319方组分别有4只和3只出现腹水，见表1。

3．2各组血清ALT、AST活性、总胆红素及A1b比含量的变化：

模型组血清ALT、AST活性及胆红素含量显著高于正常组，319方组显著低于模型组相，三者间差异均有显著性（P<0.05）。模型组的A1b比含量显著低于正常组，319方组显著高于模型组，三者间差异均有显著性（P<0.05）。见表2。

3．3各组肝组织Hyp含量的变化：

以每克湿重肝组织所含Hyp计，模型组明显高于正常组，而319方组显著低于模型组，见表2。

3．4各组血清HA含量的变化：模型组血清HA含量显著高于正常组，而319方组较模型组显著降低，见表2。

表1各组死亡率、腹水率及肝、脾、体重情况比较（±s）

死亡数/总数

腹水（只%）

肝/体重（%）

脾/体重（%）

334.1±33.0

3.70±0.73*

321.1±55.2

3.33±0.85*

*与正常组比较，P<0.01

表2各组血清ALT、AST活性、A1b、总胆红素、HA及肝组织Hyp含量比较（±s）

胆红素（mg/d1）

Hyp（µg/g湿重肝）

15.22±5.54

132.3±15.14

40.31±2.67

102.20±12.6

112.37±11.93

86.66±20.20*

207.84±21.40*

28.88±1.76*

0.67±0.19*

154.34±42.69

292.83±36.78*

34.75±13.53△

164.90±20.20

31.61±2.52△

111.75±32.65△

215.03±75.46△

与正常组比较*P<0.05；与模型相比较，△P<0.05

3．5各组肝组织病理变化

3．5．1HE染色标本观察

正常组大鼠肝细胞束排列整齐，细胞呈立方形，无变性，坏死改变，肝实质内未见炎细胞浸润。模型组大鼠肝组织可见出血性坏死，个别肝细胞水样变性，并可见炎细胞浸润，门脉区有大量的结缔组织增生，可见纤维间隔向小叶内伸展；319方组大鼠肝细胞变性坏死程度较对照组轻，肝组织内结缔组织丧生改善较为明显。在胶原纤维染色切片观察到，模型对照组大鼠胶原纤维增生明显，319方组胶原增生程度显著轻于模型组（p<0.05）。见表3。

3．5．2肝窦壁第Ⅷ因子相关抗原，层粘连蛋白，Ⅳ型胶原及α-SMA免疫组化观察：

第Ⅷ因子相关抗原阴性对照染色未见非特异性阳性灶。正常组大鼠阳性灶仅出现于中央静脉和汇管区血管壁，肝窦壁未见阳性灶。模型组阳性染色除出现在中央静脉和汇管区血管壁外，较多肝窦壁被染成黄褐色，且范围较广。319方组大鼠肝窦壁vWF阳性范围轻于模型组，图像定量分析显示，319方组肝窦壁阳性面积比明显少于模型组（p<0.05），见表4。层粘连蛋白阴性对照染色未见非特异性阳性灶。正常大鼠肝脏中LM主要分布在血管和胆管的基膜处，肝窦壁仅呈不连续弱阳性，汇管区基质为阴性。模型组大鼠肝窦壁LM的阳性染色显著增强，分布范围也较广。319方组大鼠肝窦壁LM的阳性程度与模型组比较有所减轻，图像定量分析显示，治疗组肝窦壁阳性面积比明显少于模型组（p<0.05），见表4。

Ⅳ型胶原空白对照染色未见非特异性阳性灶。正常大鼠肝脏中Ⅴ型胶原主要分布在血管和胆管的基底膜处，肝窦壁周围也有较多分布，呈连续线状阳性。模型组大鼠除纤维间隔中有阳性表达外，肝窦壁Ⅳ型胶原阳性染色也有所增强，线状阳性明显增粗。319方组肝窦壁Ⅳ型胶原阳性程度有所减轻，图像定量分析显示治疗组肝窦壁阳性面积比明显少于模型组（p<0.05），见表4。

α-SMA空白对照染色未见非特异性阳性灶。正常鼠肝除汇管区血管壁显示。α-SMA阳性外，肝小叶内未见阳性反应。模型组大鼠除纤维间隔中有大量阳性表达外，肝窦壁α-SMA的阳性染色也显著增强，319方组大鼠肝血窦壁阳性反应减弱，图像定量分析显示、治疗组肝窦壁阳性面积比明显少于模型组（p<0.05），见表4。

3．5．3肝组织超微结构观察结果：

正常组大鼠肝窦内皮细胞外周胞浆很簿，有许多小窗孔，内皮下未见基底膜，模型组大鼠表现为肝窦扭曲、狭窄，内皮细胞胞浆窗孔减少或消失，有程度不等的基底膜出现。319方组肝窦扭曲、狭窄程度有所减轻，内皮窗孔减少和消失程度较模型组轻，基底膜较薄或不连续，有的肝窦结构接近正常。

表3各组胶原纤维增生程度比较（只）

肝脏胶原纤维增生程度

正常组（7）

模型组（11）

治疗组（14）

表4各组大鼠肝窦壁vwF、LM、Co1Ⅳ、α-SMA阳性面积比的比较（±s）

正常组（7）

模型组（11）

2.07±0.98*

4.51±1.26*

7.21±1.17*

3.76±0.91*

治疗组（14）

1.14±0.92△

3.50±1.07△

与正常组比较*P<0.05；与模型组比较，△P<0.05