医学论文,金属硫蛋白对急性镉中毒后抗氧化酶的保护作用

金属硫蛋白对急性镉中毒后抗氧化酶的保护作用

中国病理生理杂志1999年第7期第15卷论著

作者：金慧英　李法卿　李素芹　谭维国　陈华标

单位：金慧英　李法卿　李素芹　谭维国　陈华标南京军区军事医学研究所（南京　210002）

关键词：金属硫蛋白；抗氧化酶；镉中毒；过氧化氢酶

　　摘　要　目的：探讨金属硫蛋白（MT）对抗氧化酶的保护作用机制。方法：向大鼠尾静脉注射氯化镉建立镉中毒模型，分别于注射后不同时间测定肝组织MT的含量和抗氧化酶（SOD,CAT,GSHpx）的活力变化。结果：镉中毒后30min～3h,SOD、GSHpx和CAT活力显著降低（P＜0.05），6h酶活力逐步恢复；MT的显著增加出现在3h,6h达最高峰（131.95±15.15）μg/g肝组织，随着MT的合成增加，抗氧化酶的活力逐步恢复。结论：镉中毒严重抑制抗氧化酶的活力，MT对抗氧化酶的活力恢复可能有良好的促进作用。

Functionofmetallothioneinprotectantioxidases

　　againstcadmiumtoxication

JINHui-Ying,LIFa-Qing,LISu-Qin,TANWei-Guo,CHENHua-Biao

　　InstituteofMilitaryMedicineofNanjingCommandPLA,Nanjing（210002）

　　AbstractAIMandMETHODS：Tostudythefunctingofmetallothionein（MT）protectantioxidases,wesetupratcadmiumtoxicalmodelbyintravenousinjectingcadmiumchloride,thendeterminedthecontentofMTandchangesofactivitiesofantioxidases（SOD,GSHpx,CAT）incadmium-exposedratliverofdifferenttimecourse.RESULTS：ActivitiesofSOD,GSHpx,CATdecreasedobviously（P＜0.05）infirst30min～3haftercadmiuminjectionandrecoveredprogressivelyin6h;MTappearedat3h,reachingitsclimaxat6h（131.95±15.15μg/g,liver）.ActivitiesofantioxidasesrecoveredprogressivelyfollowingtheraiseofMTsyntheses.CONCLUSION：Cadmiumtoxicationcaninhibitetheactivitiesofantioxidases,andMTmaybecontributetotherecoveringofantioxidases.

　　MeSH　Metallothionein;Antioxidase;Cadmiumtoxication;Catalase

　　重金属镉（cadmium,Cd）污染是一项主要的环境及职业公害。急性镉中毒可对机体造成严重损伤。有研究表明镉可竞争性替代细胞内依赖金属的抗氧化酶中的金属，抑制酶的活力。金属硫蛋白（metallothionein,MT）是小分子富含巯基的可诱导蛋白，有7个金属结合位点，所以在MT产生后与镉的亲和力显著升高，且MT自身又有清除自由基的作用。因而，本题旨在研究急性镉中毒后肝脏抗氧化化酶的变化及MT对抗氧酶活力恢复的促进作用，为临床防治镉中毒以及抗氧化剂MT在各种与氧化损伤有关的疾病中的应用奠定基础。

　　材料与方法

　　（一）动物：雄性SD大鼠，240～300g，第二军医大学实验动物中心提供。

　　（二）试剂和仪器：三羟甲基氨基甲烷（Tris）、胆酸钠（E.M.K公司，德国），二硫二硝基苯甲酸（DTNB）、还原型谷光甘肽（GSH）（Fluka公司，德国），其余试剂均为国产分析纯。HitachihimicCR21低温高速离心机（日立公司，日本），721分光光度仪（上海第三分析仪器厂），Biorad3550酶标仪（美国）。

　　（三）方法：

　　1.大鼠镉中毒模型的建立和分组：56只SD大鼠随机分为7组，实验前自由进食和水。1组为对照组，用生理盐水尾静脉注射。6个组为实验组，按Cd2+2.5mg/kg体重的剂量尾静脉注射氯化镉，分别于注射后0.5h、1h、3h、6h、24h、48h处死。取肝组织加0.25%蔗糖溶液匀浆，4℃，15000×g离心30min，取上清测定超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSHpx）和过氧化氢酶（CAT）水平。取1g肝组织用于MT含量的测定。

　　2.各项指标的测定：

　　SOD活力的测定：邻苯三酚自氧化反应终止法［1］。GSHpx活力的测定：催化GSH氧化法［2］。CAT活力的测定：比色法［3］。MT含量测定：ELISA法。鼠肝组织匀浆后，4℃15000×g30min离心，上清80℃水浴5min，再4℃27000×g10min离心，取上清适当稀释加入96孔板4℃过夜，洗涤，1%牛血清白蛋白封闭，加兔抗鼠MT一抗（自制），37℃孵育1h，洗涤后加辣根过氧化物酶标记的羊抗兔二抗孵育，加底物反应20min后终止，酶标仪读数并与标准曲线对照计算MT的含量。以MTμg/g肝组织表示。蛋白含量测定：染料法。

　　（四）统计方法：实验数据以

　　镉中毒后大鼠肝脏MT及抗氧化酶水平的变化，见表1。

表1　镉中毒大鼠肝脏MT及抗氧化酶水平的变化

Tab1ChangesofliverMTcontentandantioxidases

　　levelaftercadmiumtoxication（

　*P＜0.05,**P＜0.01,vscontrol

　　急性镉中毒后3h肝脏MT水平为（44.99±5.68）μg/g肝组织，明显高于对照组，6h达较高峰（131.95±15.15）μg/g肝组织，24～48h均维持在高峰水平。

　　抗氧化酶GSHpx、CAT的活力均显著低于正常对照组（P＜0.05），30min～30h活力很低，6h时后有显著恢复（P＜0.05）；SOD活力在3h内显著低于对照组（P＜0.05），6h时已恢复至正常的94%，48h恢复正常。

　　急性镉中毒30min即出现抗氧化酶活力的显著下降，说明镉可直接抑制酶的活力，可能的机理是镉与酶分子中的金属发生竞争性替代作用，抑制了酶的活力，早在1980年Bauer［4］即发现镉可替代SOD中的Zn形成Cu/CdSOD，从而影响SOD的活力；镉同样可抑制GSHpx及CAT的活力，酶活力的降低，使自由基的清除受影响，自由基又加重了酶活力的抑制；这种抑制作用持续加重至3h。镉可诱导MT合成，其诱导发生在MT的转录水平，诱导后1h即有MT的mRNA升高，6～9h为MT合成的高峰［5］。我们在实验中发现，镉中毒30min～1h未见MT含量的明显变化，3h后MT的含量逐步增加，至6h达较高峰，为正常组的6.7倍，以后维持在高峰水平。随着MT合成的显著增加，抗氧化酶的活力逐步恢复，特别是SOD的活力在48h时已恢复正常。推测MT合成可显著增加与镉的结合，减少了游离镉对抗氧化酶的抑制作用，促进酶的活力恢复；同时MT富含巯基的特殊结构使之具有清除自由基和脂质过氧化的能力，其丰富的还原巯基是自由基结合的最好靶位点，因而间接地减少自由基对抗氧化酶的抑制，所以MT对抗氧化酶的活力起到了保护作用。

　　实验中CAT的活力在镉中毒1h时比30min有显著升高，考虑镉中毒30min时CAT和GSHpx活力受抑，过氧化氢（H2O2）的清除减少，导致H2O2升高，而CAT作为H2O2浓度的调节器，H2O2的升高，刺激体内CAT的释放和活力升高［6］，加速分解H2O2，我们称之为正反馈作用，但镉的抑制作用最终导致了3h时CAT活力的再次下降。

　　参考文献

　　1　静天玉，赵晓瑜.用终止剂改进超氧化物歧化酶邻苯三酚测活法.生物化学与生物物理进展，1995，22：84.

　　2　唐琴华，徐晓琴，黄履成，等.血清谷胱甘肽过氧化物酶比色测定法.临床检验杂志，1993，11：124.

　　3　雷柏平，周伯通，蔡宏伟，等.过氧化氢酶活性的比色测定法.临床检验杂志，1993，11：73.