非霍奇金淋巴瘤BCL-XL基因表达及突变的研究

作者：刘元华,ChristopheLeboeuf,金晓龙,肖家诚,AnneJanin,陈赛娟，赵维莅

【摘要】本研究探讨78例非霍奇金淋巴瘤BCL-XL表达和突变的发生率及其临床意义。应用激光微切割技术从淋巴结组织中特异地分离淋巴瘤细胞，用实时定量RT-PCR法检测淋巴瘤组织和淋巴瘤细胞中BCL-XL的表达，PCR直接测序法检测BCL-XL的突变情况。结果表明：与淋巴结反应性增生（15例）相比，滤泡性淋巴瘤（30例）组织和微切割的淋巴瘤细胞均高表达BCL-XL（P值分别为0.0064和<0.0001），而T细胞淋巴瘤（24例）和弥漫性大B细胞淋巴瘤（24例）中BCL-XL表达无明显升高。在滤泡性淋巴瘤中，BCL-XL高表达的患者常伴多个淋巴结外器官累及（P=0.0004），血清乳酸脱氢酶水平升高（P=0.0019），国际预后指数分组多为高危组（P=0.0013），患者总生存期短（P=0.0451）。突变检测发现1例滤泡性淋巴瘤BCL-XL的同义突变（密码子109ACA→ACC）。结论：BCL-XL表达与滤泡性淋巴瘤的疾病进展和患者预后密切相关。

【关键词】非霍奇金淋巴瘤；BCL-XL基因；基因表达；基因突变

　　BCL-XLExpressionandMutationinNon-Hodgkin′sLymphomaAbstractThestudywasaimedtoinvestigatetheBCL-XLexpressionandmutation,anditsclinicalsignificanceinnon-Hodgkin′slymphoma.Lymphomacellswereselectivelyisolatedbylasermicrodissection.BCL-XLexpressionfromlymphomatissueandmicrodissectedlymphomacellswasmeasuredbyusingreal-timequantitativereversetranscription-polymerasechainreaction.BCL-XLmutationwasanalyzedbyusingdirectsequencingofPCRproducts.Theresultsshowedthatcomparedto15patientswithreactivehyperplasia,BCL-XLwasoverexpressedinfollicularlymphoma（n=30）,bothinlymphomatissue（P=0.0064）andinmicrodissectedlymphomacells（P<0.0001）.NosignificantriseofBCL-XLexpressionwasobservedinpatientswithT-celllymphoma（n=24）anddiffuselargeBcelllymphoma（n=24）.Infollicularlymphoma,highBCL-XLlevelwasassociatedwithmultipleextranodalinvolvement（P=0.0004）,elevatedlactatedehydrogenaselevel（P=0.0019）,high-riskinternationalprognosticindex（P=0.0013）andashortoverallsurvivaltime（P=0.0451）.Mutationanalysisrevealedonesynonymousmutation（Codon109ACA→ACC）inonecaseoffollicularlymphomapatient.ItisconcludedthatBCL-XLexpressioniscloselycorrelatedwithprogressoffollicularlymphomaandprognosisofpatientswithfollicularlymphoma.ThevalueofBCL-XLexpressionasaprognosticmarkerinfollicularlymphomashouldbeconsidered.

　　KeywordsNon-Hodgkin′slymphoma;BCL-XLgene;geneexpression;genemutation

　　淋巴瘤是一种起源于淋巴组织的恶性肿瘤，分为霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤。近20年来，非霍奇金淋巴瘤在世界范围内的发病率几乎增长了1倍，严重危害人类的健康［1］。因而探索淋巴瘤的发病机制、掌握淋巴瘤的疾病进展相关基因，对于淋巴瘤的诊断治疗前景，特别是开展个体化诊治和基因靶向治疗具有重要意义。

　　凋亡异常对于恶性肿瘤的发生发展起着相当关键的作用。凋亡受阻致使肿瘤细胞寿命延长，异常堆积，最终引起细胞转化和肿瘤形成［2］。同时，诱导凋亡又是肿瘤治疗，包括化疗药物治疗、放射治疗和免疫治疗的重要机制之一。凋亡抑制可使肿瘤细胞产生耐药，导致治疗失败或疾病复发［3］。细胞凋亡主要通过两个途径：外源性途径和内源性途径。后者起始于线粒体细胞色素C的释放，作用于凋亡蛋白酶激活因子（apoptoticprotease-activatingfactor-1，Apaf-1），诱导caspase-9活化，导致细胞凋亡［2］。BCL-2家族在调节凋亡的内源性途径中起着重要作用，按其功能不同主要分为两类：一类是促凋亡蛋白，包括BAX、BAK、BOK、BCL-XS、BID、BAD等，另一类是抗凋亡蛋白，包括BCL-2、BCL-XL、BCL-W、MCL-1、A1等［4］。在非霍奇金淋巴瘤中，内源性途径受抑也是影响肿瘤细胞凋亡的重要因素［5］。BCL-XL是BCL-2家族的主要凋亡抑制因子，由BCL-X编码，后者位于20q11.21，由3个外显子组成。BCL-X缺陷的小鼠表现为幼稚淋巴细胞的凋亡明显增加，同时亦证实BCL-XL在淋巴瘤中表达［6，7］。然而，它在不同类型淋巴瘤中的表达情况和与疾病进展的关系尚缺乏系统的研究。本研究应用实时定量RT-PCR法检测78例患者淋巴瘤组织和细胞中BCL-XL的表达，应用PCR直接测序法检测是否存在BCL-XL突变，探讨BCL-XL的表达及基因突变在淋巴瘤发生发展中的意义。

　　材料和方法

　　患者共78例,来自上海交通大学医学院附属瑞金医院和法国巴黎第七大学圣路易医院，其中男38例，女40例，年龄21-88岁，中位年龄52岁。按WHO病理分型，78例中T细胞淋巴瘤24例，弥漫性大B细胞淋巴瘤24例，滤泡性淋巴瘤30例。对照组为淋巴结反应性增生患者，共15例。两组均经患者知情同意后，留取部分淋巴结活检组织，-80℃冻存，用于提取DNA和RNA。另有60例健康志愿者，采集其外周血，提取DNA，作为基因突变检测对照。

　　激光微切割

　　用淋巴结冷冻组织制备7μm切片，70%酒精固定，苏木素-伊红染色。应用激光微切割仪（LEICA公司产品）切割约1500个淋巴瘤细胞，自动置入TRIzoL中，用于RNA提取。

　　DNA提取

　　按常规酚-氯仿抽提，冷无水乙醇沉淀法提取基因组DNA［8］，最后溶于适量TE中。紫外分光光度计测定样品DNA含量。

　　RNA提取

　　淋巴结组织总RNA经制备10-15片10μm冰冻组织切片后提取，淋巴瘤细胞总RNA直接从激光微切割的细胞中提取，操作参照TRIzoL试剂盒说明书进行。

　　cDNA合成

　　通过逆转录反应将RNA转化为cDNA。25μl逆转录体系包括：5×逆转录缓冲液5μl；dNTP5μl；Oligo-dT2μl；逆转录酶MMLV（Promega公司产品）1μl；RNasin0.5μl，淋巴结组织模板为1μg总RNA，激光微切割的淋巴瘤细胞模板为所有微切割产物提取的总RNA产物。反应条件：42℃60分钟，90℃5分钟，4℃保存。

　　实时定量PCR

　　BCL-XL和TBP（humantranscriptionfactorIID/TATAbindingprotein）的TaqMan定量PCR试剂购自PEAppliedBiosystems公司，通过ABIPRISM7700定量PCR仪检测。TBP作为内参校正样本量，同时将表达BCL-XL的Jurkat细胞系［9］作对照。定量PCR结果参照2（-ΔΔCT）法计算［10］，所示数值为每个标本BCL-XL表达量和Jurkat细胞BCL-XL表达量的比值。