PDCD5在成人急性髓性白血病骨髓细胞的异常表达

作者：阮国瑞，陈珊珊，马曦，常艳，王卉，付家瑜，秦亚溱，李金兰，刘艳荣

【摘要】　　为了研究成人急性髓性白血病（acutemyeloidleukemia，AML）骨髓细胞凋亡促进分子――PDCD5的表达，以探讨PDCD5在AML发病机制中的作用，利用21种不同荧光标记的单克隆抗体标记骨髓细胞，通过流式细胞术检测AML病人及正常人骨髓不同群细胞的胞内PDCD5的表达。部分标本进行蛋白印迹实验检测AML病人及正常人骨髓细胞内PDCD5的表达。结果表明：36例未治AML病人骨髓总的有核细胞内PDCD5平均荧光强度明显低于30例正常人组，分别为3059±1392：7432±1261（P<0.01），其中未治AML病人骨髓粒细胞、单核细胞、幼稚细胞及淋巴细胞内PDCD5平均荧光强度均低于相应的正常人组骨髓细胞，分别为3939±2121：8367±1045；3156±1635：5917±2329；2824±1592：3998±2106；1474±816：3355±2042（P值均小于0.01）。部分标本进行蛋白印迹检测的结果也显示AML病人骨髓细胞内PDCD5的表达低于正常人。结论：未治AML病人骨髓总有核细胞的PDCD5表达低于正常人，未治AML病人骨髓粒细胞、单核细胞、幼稚细胞及淋巴细胞内PDCD5表达均低于正常人组骨髓细胞。PDCD5的异常表达可能在AML的病理机制中起到一定的作用。

【关键词】急性髓性白血病PDCD5骨髓细胞　细胞凋亡

　　AbnormalExpressionofPDCD5intheBoneMarrowCellsofAdultAcuteMyeloidLeukemia

AbstractTheobjectiveofthisstudywastoestimateanovelapoptosispromotingmoleculePDCD5expressioninthebonemarrowcellsfromadultacutemyeloidleukemia（AML）forinvestigationofitssignificanceinthepathogenesisofAML.FlowcytometryassaywasusedfordetectionofPDCD5expressioninthedifferentgroupsofcellsfrombonemarrowofAMLpatientsandnormalcontrolsbyusing21monoclonalantibodieswithdifferentfluorescentmarkers.ThePDCD5expressionsinbonemarrowcellsfromsomeAMLpatientsandnormalcontrolswerealsodetectedbyWesternblot.TheresultsshowedthatthemeanPDCD5fluorescenceintensityinbonemarrownucleatedcells（MNC）fromthebonemarrowof36untreatedAMLpatientswassignificantlylowerthanthatfromthebonemarrowof30normalcontrols（3059±1392）vs（7432±1261）（P<0.01）.ThemeanPDCD5fluorescenceintensitywaslowerinthemarrowgranulocytes,monocytes,blastcells,andlymphocytesfromuntreatedAMLpatientsthanthatfromnormal（3939±2121）vs（8367±1045）;（3156±1635）vs（5917±2329）;（2824±1592）vs（3998±2106）;（1474±816）vs（3355±2042）respectively,（allP<0.01）.WesternblotanalysisdemonstratedthatPDCD5expressionwassignificantlydecreasedintheAMLcells,ascomparedwithnormalcells.ItisconcludedthatPDCD5expressioninMNCinuntreatedAMLpatientsislowerthanthatinthenormal.PDCD5expressioninthemarrowgranulocytes,monocytes,blastcells,andlymphocytesofuntreatedAMLpatientsissignificantlylowerthanthatinthenormal.ItsuggeststhattheabnormallylowexpressionofPDCD5maybeinvolvedinthepathogenesisofAML.

KeywordsAcutemyeloidleukemia;PDCD5;bonemarrowcell;apoptosis

急性髓性白血病（acutemyeloidleukemia，AML）是一种起源于造血干细胞的恶性克隆性疾病，其病理特征是原始与早期的幼稚细胞在骨髓中急剧增生，其病因尚未完全明了。TF1细胞凋亡相关基因19（TF1cellapoptosisrelatedgene19,TFAR19）是最近发现的一种新的凋亡调控基因［1］国际人类基因命名委员会将其命名为PDCD5（programmedcelldeath5）,其编码的蛋白主要定位于细胞内，在人类50余种组织中广泛分布。我们以前的研究发现，PDCD5蛋白的异常表达可能在慢性髓性白血病疾病进展中起一定作用［2］，但在AML病人细胞中是否存在异常表达，尚不清楚，本研究应用流式细胞术标记技术，首次研究了成人AML与正常供者骨髓（normaldonormarrow，NDM）不同细胞群胞内PDCD5的表达情况。

成人未治AML病人骨髓标本36份，AML病人治疗后部分及完全缓解的骨髓标本18份；AML诊断及分期依据国际标准；同种异基因骨髓移植供者骨髓30份作为正常对照。

牛血清白蛋白（BSA）购自军事医学科学院药材供应站。标记不同荧光的小鼠抗人单克隆抗体CD45PerCP（多甲藻叶绿素蛋白）、CD7FITC（异硫氰酸荧光素）、CD117PE（藻红蛋白）、CD33APC（别藻蓝蛋白）、CD34FITC、CD10PE、CD19APC、CD38FITC、CD56PE、HLADRAPC、CD13FITC、CD64PE、CD11bAPC、CD14APC、CD15FITC、CD71FITC、CD16FITC胞浆MPOFITC及小鼠IgGFITC、IgGAPC、IgGPE共21种均购自BectonDickinson及PharMingen公司。FITC标记的小鼠抗人单克隆抗体PDCD5由北京大学人类疾病基因研究中心馈赠［3］。FACSTMpermeabilizingsolution，FACSlysingsolution购自美国BectonDickinson公司。

流式细胞术分析

无菌采集的骨髓标本，常规肝素抗凝，每管取10-100μl（约含细胞5×105-1×106），分别按如下6管进行3-4色荧光抗体标记（抗体加入量按公司说明书进行）。1号管：CD45PercP/IgGFITC/IgGPE/IgGAPC；2号管：CD45PercP/CD7FITC/CD117PE/CD33APC；3号管：CD45PercP/CD34FITC/CD10PE/CD19APC；4号管：CD45PercP/CD38FITC/CD56PE/HLADRAPC；5号管：CD45PercP/CD13FITC/CD64PE/CD11bAPC；6号管：CD45PercP。

室温避光保存20分钟后，用红细胞裂解液（FACSlysingsolution）溶解红细胞，用0.067mol/L的PBS（含5g/LBSA）洗涤，2、3、4、5号管补充0.067mol/LPBS500μl准备上机；1、6号管各加500μl破膜剂（FACSTMpermeabilizingsolution）破膜10分钟，用0.067mol/L的PBS（含5g/LBSA）洗涤后，6号管中加入5μlFITC标记的小鼠抗人单克隆抗体PDCD5，用0.067mol/L的PBS（含5g/LBSA）洗涤后，补充0.067mol/L的PBS500μl准备上机（其中4及5号管根据1、2、3号管上机结果可分别另选CD15FITC/CD71FITC/CD16FITC/胞浆MPOFITC/CD14APC进行标记）。

根据FCM散点图，以1号管为阴性对照，对2、3、4、5、6号管以CD45/SSC分别设门后，依据各群细胞CD45/SSC特性及表达CD分子不同［4］，可将散点图划分为五个群体，分别为幼稚细胞、粒细胞、单核细胞、淋巴细胞及有核红细胞（图1），然后用FCM软件cellquest计算测定管中总的有核细胞及各群细胞的PDCD5表达百分率及每个细胞的平均荧光强度。图2显示流式细胞术检测1例未治AML病人骨髓不同群细胞内PDCD5表达百分率（a）及平均荧光强度（b）。