医学论文,从噬菌体抗体库筛选获得中和性人源抗甲型肝炎病毒Fab抗体

从噬菌体抗体库筛选获得中和性人源抗甲型肝炎病毒Fab抗体

中华实验和临床病毒学杂志2000年第4期第14卷论　著

作者：曹经瑗　梁米芳　郭可謇　孟庆玲　尚丹　李德新　詹美云

单位：曹经瑗　郭可謇　孟庆玲　尚丹　詹美云（中国预防医学科学院病毒学研究所肝炎研究室　北京　100052）；梁米芳　李德新（出血热研究室）

关键词：肝炎病毒；甲型；免疫球蛋白类Fab；噬菌体抗体库

　　【摘要】　目的　研制人源抗甲型肝炎病毒基因工程抗体，为预防甲型肝炎病毒感染提供有效的方法。方法　采用噬菌体表面展示技术，从一名甲型肝炎恢复期病人的抗凝血中分离淋巴细胞，提取总RNA逆转录后，用一组人IgGFab特异性引物扩增。结果　克隆和表达了8株人源抗甲型肝炎病毒抗体Fab段基因，经ELISA检测为特异性人抗甲型肝炎病毒Fab段抗体。结论　该8株人源抗甲型肝炎病毒Fab抗体都能与具有中和活性的鼠抗甲型肝炎病毒单克隆抗体产生竞争抑制反应，选其中的2株做体外中和实验，证明都有中和甲型肝炎病毒的活性。

HumanFabantibodiesderivedfromphagedisplaylibraryneutralizehepatitisAvirusinvitro

CAOJingyuan,LIANGMifang,GUOKejian

　　（InstituteofVirology,ChineseAcademyofPreventiveMedicine,Beijing100052,China）

　　【Abstract】　Objective　DevelopmentofrecombinanthumanmonoclonalantibodytohepatitisAvirusasaemergentmeasureforpreventionofhepatitisAvirusinfection.Methods　HumanneutralizingmonoclonalantibodyFabfragmentstoHAVhavebeendevelopedbyusingphagedisplaytechnique.TheheavyandlightchainsofhumanIgGFabgeneswereamplifiedfromaHAVpatientinconvalescentstage.ThecombinatorialphageantibodylibrarywasestablishedbyinsertingbothheavyandlightchainsofFabgenesintophagemidvectorpComb3andfollowedbyhelpphageinfectionafter4roundsofpanningwithpurifiedHAVascoatedantigen.Results　ThehumanFabfragmentstoHAVwereselectedandexpressedinbacteria.Conclusion　ThespecificbindingofFabantibodiestoHAVweredemonstratedbytheirreactionwithHAVantigeninELISA.TheseresultsprovidethebasisforfurtherdevelopmentofaneutralizingrecombinanthumanwholeIgGmoleculeandholdpromiseforfutureuseintheprophylaxisofHAVinfection.

　　【Keywords】　HepatitisAvirus;　Immunoglobulins,Fab;　Phagedisplaylibrary

　　甲型肝炎病毒属小RNA病毒科甲型肝炎病毒属，是经肠道传播的疾病。甲型肝炎病毒虽不易导致慢性感染，但危害人民的身体健康，并且能够造成一定的经济损失。虽然有甲型肝炎疫苗可以应用，但并没有纳入计划免疫。高效价人源免疫球蛋白作为一种被动免疫手段，在一旦有发病或流行征兆时使用不失为一种有效的应急措施。但人源制品来源困难且可能有病原微生物的污染，动物抗体因异种蛋白不宜应用〔1，2〕。随着分子生物学和分子免疫学研究的发展，体外表达基因工程单克隆抗体已经成为可能。近年发展起来的噬菌体表面展示技术中比

　　较有代表性的表达系统是美国Scripps研究所的pComb3系统〔3，4〕。目前研究成功的有：抗呼吸道合胞病毒（RSV）抗体〔5〕，抗乙型肝炎病毒表面抗原（HBsAg）抗体〔6〕，抗汉坦病毒抗体〔3〕及抗丙型肝炎（HCV）抗体〔7〕等。本文报道用噬菌体抗体库技术克隆出具有中和活性的抗甲型肝炎病毒的人源单克隆抗体及其特异性鉴定。

　　1　材料和方法

　　1.1　材料来源　实验所用质粒为pComb3〔4〕，辅助噬菌体为VSCM13，均为美国Scripps研究所馈赠。大肠埃希菌菌株为XL1Blue。甲型肝炎病毒毒株为JN13，由本室分离保存传至13代。用于甲型肝炎病毒增殖的细胞株为FRHk4细胞。

　　1.2　人源IgGFab段基因的逆转录-PCR法扩增　用淋巴细胞分离液（上海试剂二厂）从一甲型肝炎病人恢复期10ml抗凝血中（用等体积Hank′s液稀释后）分离淋巴细胞，具体方法参见文献〔8〕，用Trizol试剂提取总细胞RNA，溶于45μlDEPC处理的水中，用cDNA合成试剂盒（美国GibcoBRL公司）通过Oligo-dT引物经逆转录合成cDNA，用一组特异性人IgGFabκ链、λ链及γ链引物（参见文献〔3〕），对人源轻链和重链Fd基因进行PCR扩增。

　　1.3　噬菌体抗体基因库的建立　基本参见文献〔3〕。先将轻链用XbaⅠ/SacⅠ酶切，与相应酶切后的载体质粒pComb3连接，用电穿孔转化大肠埃希菌XL1Blue细胞，扩增转化后的细菌，提取质粒得到轻链载体DNA，将此载体用XhoⅠ/SpeⅠ酶切，与用XhoⅠ/SpeⅠ酶切的重链Fd片段连接，电转入XL1Blue细胞，按文献〔3〕所述建立噬菌体抗体库。

　　1.4　用于抗体富集筛选的甲型肝炎病毒抗原的制备　甲型肝炎病毒在Frhk4细胞上培养24d后收获，基本按文献〔9〕方法通过蔗糖垫层超速离心纯化甲型肝炎病毒抗原，纯化后的甲型肝炎病毒抗原可直接用于包被ELISA板。

　　1.5　噬菌体抗体库的特异性富集筛选　基本按文献〔4〕进行。将上述纯化的甲型肝炎病毒抗原1∶50（ELISAA值大于1.5）稀释后每孔60μl包被6孔ELISA板，经封闭后，加入上述噬菌体抗体库60μl/孔，经吸附-洗涤-洗脱后，按文献〔3〕中程序经培养及辅助噬菌体感染后进行下一轮筛选。如此反复筛选4～5次。

　　1.6　重组抗体的制备及阳性克隆的ELISA检测　基本按文献〔3，4〕进行。用纯化甲型肝炎病毒抗原包被ELISA板，加入上述抗体，用辣根过氧化物酶标记的羊抗人Fab抗体（Sigma公司产品）检测。阴性对照为载体pComb3转化菌或抗汉坦病毒Fab抗体转化菌按同样方法制备的细菌裂解液。

　　1.7　重组抗体的竞争抑制实验　用纯化的鼠抗甲型肝炎病毒单克隆抗体（本室制备）包被ELISA板孔，加入部分纯化的甲型肝炎病毒抗原，然后同时加入用上述方法筛选出的Fab阳性克隆及用辣根过氧化物酶标记的鼠抗甲型肝炎病毒单克隆抗体，仍用上述的阴性对照。以抑制率≥50%为阳性结果。

　　1.8　重组抗体的体外中和实验　基本按文献〔10〕进行。将FRhk4细胞在小试管中培养成单层，将来自不同克隆表达的Fab可溶性裂解液上清及阴性对照以0.22μm微孔滤膜无菌过滤后，1∶2稀释，然后分别各取500μl，与500μl适当稀释的经等量氯仿处理后的甲型肝炎病毒混合（本实验用了30个TCID50的病毒量），37℃孵育1.5h，每个稀释度做4管，每管接种混合物0.2ml，37℃吸附1.5h，然后每管加入0.8ml含2%牛血清的Eargle′s培养液，33℃培养24d，收获细胞，每管加入0.2ml含2%牛血清的0.01mol/LPBS，冻化3次后，ELISA检测甲型肝炎病毒抗原。本实验同时设阴性菌裂解液，甲型肝炎病毒抗体阳性人血清，病毒滴度及细胞对照。抗原检测为阴性（P/N值小于2.1）即病毒被中和。

　　2　结果

　　2.1　Fd段和轻链基因的扩增　从一甲型肝炎恢复期病人（发病后3个月）采抗凝血10ml，用竞争抑制ELISA检测其甲型肝炎病毒总抗体，滴度为1∶5120。图1显示纯化后的轻重链PCR产物经0.8%的琼脂糖凝胶电泳检测，在700bp左右见到扩增带。

图1　PCR扩增和纯化人源IgGFab轻重链基因

　　Fig.1　PCRamplificationandpurificationofhumanIgGlight

　　andheavychainsofFabgenes

　　1：λDNA/HindⅢmarker.2:MixtureofpurifiedproductsofFdchain（1a,1f,3a,4f,6a,2f）.3：MixtureofpurifiedPCRprductsofλchain（VL1，VL2，VL3，VL4，VL5，VL6）.4：MixtureofpurifiedPCRproductsofκchain（Vk1a,Vk2a,Vk3a）

　　2.2　人源噬菌体抗体库的构建和抗甲型肝炎病毒抗体特异性富集筛选　轻链电转后，取少量细菌铺盘，测定库容为106，随机挑取10个克隆，用XbaⅠ+SacⅠ酶切，有7个克隆能切出700bp左右条带，说明轻链库重组率为70%。重链经电转后，测定库容为106，挑取10个菌落，用XhoⅠ+XbaⅠ酶切鉴定，5个有轻重链共同插入，说明重链Fd段重组率为50%。经4轮富集筛选后挑选出8株人源Fab抗体，图2为有轻重链基因插入的阳性克隆用XbaⅠ和XhoⅠ酶切后的结果。带噬菌体基因Ⅲ和人抗体Fab段轻重链基因插入的克隆应切出约2.2kb的条带以及3.0kb的载体带。图3显示随筛选轮数的增加，带有双链基因插入的克隆也逐渐增加，到最后一轮约有90%克隆显示有重链和轻链基因的插入。

2　经过4轮富集筛选后8株阳性克隆的

　　内切酶鉴定（XhoⅠ+XbaⅠ）

　　Fig.2　Restrictionenzymeidentificationof8positiveFabgene

　　clonesselectedfromphageantibodylibraryafterfour

　　roundsofpanning

　　1-8:Fabgenepositiveclones.9:λDNA/HindⅢmarker

　　2.3　重组克隆的ELISA鉴定　表1表明，所有8株具有双链基因插入的克隆均能与甲型肝炎病毒抗原反应，而阴性对照不能与甲型肝炎病毒抗原反应。8株重组抗体在1∶1000稀释时均能与HRP标记的鼠抗甲型肝炎病毒单克隆抗体产生竞争抑制反应，抑制率在90%以上，而上述阴性对照不能与鼠抗甲型肝炎病毒单克隆抗体产生竞争抑制反应，说明所筛选出来的噬菌体抗体为甲型肝炎病毒特异性抗体。见表2。

图3　有轻重链基因双链插入的克隆随筛选轮数增加而增加

　　Fig.3　EnrichmentofpositiveFabclones

　　2.4　重组人源抗甲型肝炎病毒抗体Fab段的体外中和活性　对上述2株阳性克隆表达后的细菌裂解液上清进行了体外中和实验（HAFab9及HAFab16），结果表明，这2株克隆和阳性对照血清均能中和甲型肝炎病毒，而阴性对照则不能中和，见表3。

　　3　讨论

　　我们用噬菌体表面展示技术，得到了有中和活性的抗甲型肝炎病毒人源基因工程单克隆抗体Fab段基因及表达产物，这为以后构建人源中和性抗甲型肝炎病毒全IgG分子的表达及应用打下了良好的基础。

表1用纯化的甲型肝炎抗原直接包被ELISA板，检测噬菌体抗体与甲型肝炎抗原的结合反应

　　Tab.1　SpecificbindingofexpressedhumanFabantibodieswithpurifiedHAVantigendetectedbyELISA

表2噬菌体抗体的ELISA竞争抑制实验

　　Tab.2　CompetitiveinhibitionELISAofexpressedhumanFabantibodieswithmouseMcAbforattachmenttoHAVantigen

表3　重组Fab抗体对甲型肝炎病毒的中和活性

Tab.3　Neutralizingactivityof2humanrecombinant

FabantibodiesagainstHAV

　　甲型肝炎病毒属小RNA病毒科肝病毒属，没有包膜，只有一个血清型，抗原变异小，抗原结构相对稳定，结构蛋白主要由VP1，VP2，VP3组成，VP4较小，很少在病毒表面检测到。主要中和抗原结合位点在VP1和VP3的位置并且是构型依赖性，它的中和抗原决定簇是由密切相关的排列紧密的一组抗原位点组成〔11〕。我们得到的重组Fab克隆能中和甲型肝炎病毒，从目前结果看两倍稀释的粗制Fab抗体能完全中和30个TCID50的病毒量，但是否能中和更多的病毒则需将Fab抗体纯化浓缩后，进一步加大病毒量和抗体量做中和实验。虽然此次中和实验只用了两株重组Fab抗体，但我们得到的这几株重组人抗甲型肝炎病毒抗体Fab段均能与鼠抗甲型肝炎病毒单克隆抗体产生竞争抑制反应，而后者又能与人抗甲型肝炎病毒恢复期血清产生竞争抑制反应，且鼠抗体及人恢复期血清都有中和甲型肝炎病毒的活性，故推测我们得到的其他重组Fab抗体也应有中和活性。

　　从实验中8株Fab单抗与鼠单抗的竞争抑制实验表明，我们得到的这几株克隆很可能是抗同一位点的克隆。故应筛选更多的具有中和活性且抗不同位点的克隆。用常规Westernblot难以检测到我们得到的重组Fab抗体到底是抗甲型肝炎病毒哪种结构蛋白的，但从我们初步的与抗VP1鼠单抗的竞争抑制实验表明，我们的单抗很可能是抗VP1的，这些还需进一步实验证实。本课题受国家自然科学基金资助（39700123）

参　考　文　献

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