密度感知系统对铜绿假单胞菌感染的免疫作用王炜芳 ,论文发表，论文代写

　　[摘要]目的研究密度感知信号（Qs）系统在铜绿假单胞（PA）菌致大鼠肺部感染中的免疫调节作用，探讨其作用机制。方法（1）300只健康清洁级sD大鼠随机分为3组，应用锐孔喷射装置，制成两株铜绿假单孢菌（野生型铜绿假单孢菌PA01及密度感知基因缺失的变异株PA01．JP2）藻酸盐包裹体凝胶小珠，接种至大鼠肺部，建立两组慢性肺部感染模型，以无菌生理盐水一藻酸盐包裹体接种组作为对照组。（2）在接种后3、7、14、28d，取每组大鼠肺组织匀浆和血清检测，比较各组大鼠肺组织中免疫学指标IFN-γ、IL-4及血清中IgG、IgM、IgGl、IgG2a的不同，评价两株菌的致病差异性。结果（1）PAOI感染组大鼠死亡率（29.7％）明显高于PAO1－JP2感染组（11.0％）。（2）与PAO-JP2组相比，在感染早期（第3天），PAO1组肺组织中IFN-γ明显升高；在感染的中期（第7天），PAOI组IFN-γ、IL-4均显著升高，感染的后期（第14－28天），PAO1组IFN－γ、IgG2a持续降低，IL-4、IgG、IgGl则持续升高。结论Qs系统通过干预机体免疫系统和调控致病因子，在PA菌致病及免疫调节中起重要作用。　　[关键词]密度感知系统；铜绿假单孢菌；N－乙酰同型丝氨酸内酯　　日益增多的广谱抗菌药物的应用，产生了细菌多药耐药、菌群失调等负面作用，使抗菌药物受到了很大挑战。这促使研究者们注意到通过减低细菌毒力来控制感染。而细菌密度感知信号（QuorumSensing，Qs）系统的发现则极有可能提供了这样的目标位点，此系统通过释放信号因子（Autoinduce，AI）来调节许多毒性因子的表达。应用AI拮抗剂，即可抑制细菌的致病因子、减弱其毒力，并极易被宿主免疫系统清除，以达到抗感染治疗的目的。国外关于铜绿假单孢菌（PA）QS系统的体外分子水平分析研究进步很快，但是探讨其在体内致病机制、尤其是慢性肺部感染中所起的免疫调节作用的研究相对较少。本研究以此为切入点，通过比较野生型PA菌株PAO1（含LasR．LasI和RhlR-RhlI基因）及其QS系统缺失的变异菌株PAO1－JP2（LasR-LasI和RhlR-RhlI基因均缺失，不表达N－乙酰同型丝氨酸内酯，AHIS）在大鼠肺部感染中的致病性及免疫细胞因子表达的差异，阐明Qs系统在PA菌呼吸道感染中所起的致病及免疫调节作用，并探讨其机制。　　　　1　材料与方法　　　　1．1材料　　1．1．1动物健康清洁级Sprague―Dawley（sD）大鼠300只，体重180－220g，7周龄，雌雄各半，由解放军总医院动物中心提供。随机分为3组，分别为PA01感染组，PA01－JP2感染组，无菌藻酸盐对照组。　　　　1．1．2菌株PA菌株两株，由丹麦哥本哈根大学吴红博士提供。分别是可以表达AHIS的野生型菌株PAO1及其不表达AHLS的变异菌株PAO1－JP2。　　　　1．1．3主要试剂和仪器藻酸盐（sigma公司，美国），大鼠IFN-γ、IL-4定量ELISA测定试剂盒（R&D公司，美国），锐孔喷射装置（中国科学院低温中心），比浊仪（biomerieux，法国），显微病理成像分析系统（OLYMPUS，日本）　　　　1．2实验方法　　1．2．1PA菌藻酸盐包被体的制备　　将藻酸盐粉末溶解在0.9％NaCl中，质量浓度为11mg／ml，高压灭菌，新鲜培养18h的细菌培养物1ml，与9ml无菌藻酸盐溶液混合，用比浊仪调节菌落最终浓度为3麦氏单位。混悬液放入锐孔喷射装置的圆柱形容器中，容器上方、侧壁、下方分别有三个小孔（3mm*3mm）。容器的上方小孔接入压缩空气，推动混悬液向下方小孔流动，在距容器底部下方小孔1cm处的侧壁孔接入压缩空气，液体流过此处时，压缩空气流将其吹起，使之通过下方小孔针头时，形成藻酸盐飞滴，飞滴直接进入0.1mol／L的CaCl2／TRIS－HCL缓冲液中，即成直径约60－100μm小珠子。藻酸盐珠在钙浴中持续搅动1h，离心弃上清，调节菌液浓度约为5*108。相差镜下观察PA菌藻酸盐包被小珠形态。对照组无菌的小珠使用同样的方法和步骤制作，内容物为无菌的生理盐水。　　　　1．2．2动物模型的建立　　1．2．2．1接种大鼠用20％乌拉坦麻醉后固定，用16号钝头针头从口腔插入气管，将配好的藻酸盐包被的PA菌悬液或无菌悬液0.2ml缓慢注入气管，左右旋转体位，使菌液均匀分布于两肺。　　　　1．2．2．2监测指标在感染前、感染后3d、7d、14d、28d五个时间点每组分别选20只大鼠，取血3ml离心，测定血清中抗PA菌抗体IgG、IgM、IgGl、IgG2a的含量。之后注射致死剂量的20％乌拉坦处死，分离出肺组织，分别进行肺组织匀浆活菌计数和病理组织学指标的检测以确立肺炎模型的建立，剩余的肺组织匀浆用于检测IFN-7、IL-4含量。　　　　1．2．3肺组织匀浆中IFN－γ、IL-4含量测定　　大鼠IFN-γ7、IL-4定量ELISA测定试剂盒（美国R&D公司）。内含96孔微孔板、标准品、生物素化抗大鼠IFN-γ／IL-4、酶标记物Streptavidin／HRP、OPD、终止液2NH2SO4。按照试剂盒说明进行操作和测定。　　　　1．2．4血清中抗PA菌抗体IgG、IgGl、IgG2a含量　　测定　　新鲜培养的PA菌标准株，调节至3麦氏浓度，冰浴下超声裂解。按280nm（A280）光吸收法测定蛋白质浓度，以包被液调节抗原浓度到10μg／ml。用PA菌抗原200~1包被酶标板，剂量2μg／孔。4℃放置过夜。次日清洗，甩干。经过封闭、加入待测血清、山羊抗大鼠－HRP，显色等步骤后，加入H2SO4终止反应，酶标仪450nm波长测定OD值。以样本OD值／正常大鼠血清OD值表示抗体值。　　　　1．3统计方法　　应用Stata7．0软件对数据进行统计学分析。计量资料采用方差分析组间两两比较采用SNk．口检验，率的比较采用x2。检验，以P　　　　2结果　　　　2．1死亡率比较　　PA01组死亡率（29.7％）明显高于PA01－JP2组（11.0％）和对照组（4.21％）（x2=27.71，P0.05）。|||　　[摘要]目的研究密度感知信号（Qs）系统在铜绿假单胞（PA）菌致大鼠肺部感染中的免疫调节作用，探讨其作用机制。方法（1）300只健康清洁级sD大鼠随机分为3组，应用锐孔喷射装置，制成两株铜绿假单孢菌（野生型铜绿假单孢菌PA01及密度感知基因缺失的变异株PA01．JP2）藻酸盐包裹体凝胶小珠，接种至大鼠肺部，建立两组慢性肺部感染模型，以无菌生理盐水一藻酸盐包裹体接种组作为对照组。（2）在接种后3、7、14、28d，取每组大鼠肺组织匀浆和血清检测，比较各组大鼠肺组织中免疫学指标IFN-γ、IL-4及血清中IgG、IgM、IgGl、IgG2a的不同，评价两株菌的致病差异性。结果（1）PAOI感染组大鼠死亡率（29.7％）明显高于PAO1－JP2感染组（11.0％）。（2）与PAO-JP2组相比，在感染早期（第3天），PAO1组肺组织中IFN-γ明显升高；在感染的中期（第7天），PAOI组IFN-γ、IL-4均显著升高，感染的后期（第14－28天），PAO1组IFN－γ、IgG2a持续降低，IL-4、IgG、IgGl则持续升高。结论Qs系统通过干预机体免疫系统和调控致病因子，在PA菌致病及免疫调节中起重要作用。　　[关键词]密度感知系统；铜绿假单孢菌；N－乙酰同型丝氨酸内酯　　日益增多的广谱抗菌药物的应用，产生了细菌多药耐药、菌群失调等负面作用，使抗菌药物受到了很大挑战。这促使研究者们注意到通过减低细菌毒力来控制感染。而细菌密度感知信号（QuorumSensing，Qs）系统的发现则极有可能提供了这样的目标位点，此系统通过释放信号因子（Autoinduce，AI）来调节许多毒性因子的表达。应用AI拮抗剂，即可抑制细菌的致病因子、减弱其毒力，并极易被宿主免疫系统清除，以达到抗感染治疗的目的。国外关于铜绿假单孢菌（PA）QS系统的体外分子水平分析研究进步很快，但是探讨其在体内致病机制、尤其是慢性肺部感染中所起的免疫调节作用的研究相对较少。本研究以此为切入点，通过比较野生型PA菌株PAO1（含LasR．LasI和RhlR-RhlI基因）及其QS系统缺失的变异菌株PAO1－JP2（LasR-LasI和RhlR-RhlI基因均缺失，不表达N－乙酰同型丝氨酸内酯，AHIS）在大鼠肺部感染中的致病性及免疫细胞因子表达的差异，阐明Qs系统在PA菌呼吸道感染中所起的致病及免疫调节作用，并探讨其机制。　　　　1　材料与方法　　　　1．1材料　　1．1．1动物健康清洁级Sprague―Dawley（sD）大鼠300只，体重180－220g，7周龄，雌雄各半，由解放军总医院动物中心提供。随机分为3组，分别为PA01感染组，PA01－JP2感染组，无菌藻酸盐对照组。　　　　1．1．2菌株PA菌株两株，由丹麦哥本哈根大学吴红博士提供。分别是可以表达AHIS的野生型菌株PAO1及其不表达AHLS的变异菌株PAO1－JP2。　　　　1．1．3主要试剂和仪器藻酸盐（sigma公司，美国），大鼠IFN-γ、IL-4定量ELISA测定试剂盒（R&D公司，美国），锐孔喷射装置（中国科学院低温中心），比浊仪（biomerieux，法国），显微病理成像分析系统（OLYMPUS，日本）　　　　1．2实验方法　　1．2．1PA菌藻酸盐包被体的制备　　将藻酸盐粉末溶解在0.9％NaCl中，质量浓度为11mg／ml，高压灭菌，新鲜培养18h的细菌培养物1ml，与9ml无菌藻酸盐溶液混合，用比浊仪调节菌落最终浓度为3麦氏单位。混悬液放入锐孔喷射装置的圆柱形容器中，容器上方、侧壁、下方分别有三个小孔（3mm*3mm）。容器的上方小孔接入压缩空气，推动混悬液向下方小孔流动，在距容器底部下方小孔1cm处的侧壁孔接入压缩空气，液体流过此处时，压缩空气流将其吹起，使之通过下方小孔针头时，形成藻酸盐飞滴，飞滴直接进入0.1mol／L的CaCl2／TRIS－HCL缓冲液中，即成直径约60－100μm小珠子。藻酸盐珠在钙浴中持续搅动1h，离心弃上清，调节菌液浓度约为5*108。相差镜下观察PA菌藻酸盐包被小珠形态。对照组无菌的小珠使用同样的方法和步骤制作，内容物为无菌的生理盐水。　　　　1．2．2动物模型的建立　　1．2．2．1接种大鼠用20％乌拉坦麻醉后固定，用16号钝头针头从口腔插入气管，将配好的藻酸盐包被的PA菌悬液或无菌悬液0.2ml缓慢注入气管，左右旋转体位，使菌液均匀分布于两肺。　　　　1．2．2．2监测指标在感染前、感染后3d、7d、14d、28d五个时间点每组分别选20只大鼠，取血3ml离心，测定血清中抗PA菌抗体IgG、IgM、IgGl、IgG2a的含量。之后注射致死剂量的20％乌拉坦处死，分离出肺组织，分别进行肺组织匀浆活菌计数和病理组织学指标的检测以确立肺炎模型的建立，剩余的肺组织匀浆用于检测IFN-7、IL-4含量。　　　　1．2．3肺组织匀浆中IFN－γ、IL-4含量测定　　大鼠IFN-γ7、IL-4定量ELISA测定试剂盒（美国R&D公司）。内含96孔微孔板、标准品、生物素化抗大鼠IFN-γ／IL-4、酶标记物Streptavidin／HRP、OPD、终止液2NH2SO4。按照试剂盒说明进行操作和测定。　　　　1．2．4血清中抗PA菌抗体IgG、IgGl、IgG2a含量　　测定　　新鲜培养的PA菌标准株，调节至3麦氏浓度，冰浴下超声裂解。按280nm（A280）光吸收法测定蛋白质浓度，以包被液调节抗原浓度到10μg／ml。用PA菌抗原200~1包被酶标板，剂量2μg／孔。4℃放置过夜。次日清洗，甩干。经过封闭、加入待测血清、山羊抗大鼠－HRP，显色等步骤后，加入H2SO4终止反应，酶标仪450nm波长测定OD值。以样本OD值／正常大鼠血清OD值表示抗体值。　　　　1．3统计方法　　应用Stata7．0软件对数据进行统计学分析。计量资料采用方差分析组间两两比较采用SNk．口检验，率的比较采用x2。检验，以P　　　　2结果　　　　2．1死亡率比较　　PA01组死亡率（29.7％）明显高于PA01－JP2组（11.0％）和对照组（4.21％）（x2=27.71，P0.05）。|||　　2．2肺炎模型的评价　　按照TANG，Pearson等定义的肺炎模型建立标准。，感染组经过肺组织匀浆菌落计数及病理学检测后，肺炎模型成功建立，对照组肺组织未培养细菌，病理学检测未出现肺部感染表现。　　　　2．3各组肺组织匀浆中IFN－γy和11－4比较　　感染后3、7d，PA01组IFN-7明显高于PAO－JP2组、对照组；感染后14、28d，PAO-JP2组IFN-γ明显高于PAO1组、对照组；组内相邻时间点比较，PAO1组感染后第3天明显高于感染前（P　　感染后3d，PA01组、PAO-JP2组IL-4明显高于对照组，该两组差异无统计学意义（P>0.05）；感染后7、28d，PA01组明显高于PAO-JP2组、对照组，后两组差异无统计学意义；感染后14d，三组差异无统计学意义。组内相邻时间点比较，PA01组和PAO-JP2组均在感染后3d明显高于感染前（P0.05）。　　　　2．4各组血清抗PA菌抗体比较　　2．4．1血清抗PA菌抗体IgG、IgM比较　　感染后3、7d，PAO1组和PAO-JP2组[gG差异无统计学意义（P>0.05）。感染后14、28d，PAO1组IgG显著高于PAO-JP2组（P0.05）。感染后7d，PA01组IgM显著高于PAO-JP2组。感染后3、7d，PA01组和PAO-JP2组IgM均高于对照组（P0.05）。组内相邻时间点比较，PA01组IgM感染后7d明显高于感染后3、14d（P　　　　2．4．2血清抗PA抗体IgG1、IgG2a比较感染后3、7d，各组IgGl差异无统计学意义（P>0.05）。感染后14、28d，PA01组、PAO-JP2组IgGl显著高于对照组（P0.05），感染后14、28d，PAO-JP2组IgG2a显著高于PAO1组、对照组（P　　　　3　讨论　　　　QS系统是一种细胞一细胞问信号传递机制，其应答反应的产生依赖于细胞的阈值浓度。1972年，发现了深海弧菌有密度依赖的发光（1uminescence）现象，即只有细菌达到了一定的密度后才开始发光。后来发现这与细菌释放的信号因子（AI）有关。当细菌增殖达到一定密度的时候，其所释放的AI的浓度也随之增高，达到一定的阈值即与细菌中的LuxR蛋白结合，而LuxR是弧菌发光基因（Luxgene）的转录调节因子，可以结合在Lux启动子的上游，从而激活Lux基因的表达，导致弧菌发光。另一方面，AI和LuxR结合后又可上调AI合成基因LuxI的表达，形成正反馈，使上述信号系统不断放大。在上述过程中，细菌通过AI感知（sensing）到周围同伴的存在，只有到了一定的密度（Quorum）才开始表现出一定的行为，所以称之为密度感知信号（Qs）系统。　　Pearson和VanDelden等研究发现，LuxR－Luxl类似的基因调节系统广泛地存在于革兰氏阳性菌和阴性细菌，调节许多致病基因的表达，成为细菌致病性方面研究的焦点。许多革兰氏阴性细菌均使用信号因子N－乙酰同型丝氨酸内酯（AHLS）来传递信号。PA具有革兰氏阴性细菌典型的Qs系统的特征，它有两套LuxR－LuxI类似调节系统：LasR－LasI及RhlR-RhlI系统。20世纪90年代早期，在PA中发现了Qs系统的组分之－LuxR的同系物，它是弹性蛋白酶基因（1asB和lasA）的转录因子，故被称为Las系统。随之发现了这个系统的第二个组分luxI的同系物lasI，即AI的合成酶。20世纪90年代中期发现了PA的第二个由luxR／luxI的同系物构成的QS系统，因为它可以调节鼠李糖脂（rhamnolipid）的生物合成，故称作rhlR／rhlI。当PA达到阈值浓度时，信号因子AHLS亦产生增多，被自身感知，便可激活Qs系统（1as和rhl系统），形成LasR-AHLS和RhlR－AHLS复合物，继而增强下游一系列毒性基因如lasA、lasB、toxA、arpA、rhlR（分别编码弹性蛋白酶A、B、外毒素A、碱性蛋白酶、鼠李糖内酯）的转录，从而调控相应毒性因子的表达而致病，并干预宿主免疫防御系统。因此，具有Qs系统的野生型PA之所以较Qs系统缺失株有较强的致病性，依赖于其所调控的毒性因子的产生。　　本部分研究结果显示：（1）与PAO-JP2组相比，PAO1组大鼠死亡率明显升高。（2）与PAO．JP2组相比，在感染早期（第3天），PAO1组IFN一7明显升高；在感染的中期（第7天），PAO1组IFN．γ、IL-4均明显升高；感染的后期（第14－28天），PA01组IFN－γ、IgG2a明显降低，IL-4、IgG、IgGl则明显升高。这表明，与Qs系统缺失的PA变异株相比，具有QS系统的野生型PA引起的感染较为严重，死亡率较高，而两组免疫学指标方面的差异，可能是PA01组感染持续存在的原因之一。　　Pearson等使用新生小鼠肺部急性感染模型和分别缺失lasI，rhlI，或lasI和rhlI基因的PAO1变异株（分别是PAO－jPl，PAO100，PAO-JP2）进行了对比研究。与PAO1株相比，这三株变异株在致死性和致肺炎、菌血症方面的能力均显示出明显的降低。最明显的降低表现在PAO-JP2株上。使用带lasI和rhlI基因的质粒做互补试验，PAO-JP2互补株致肺炎和菌血症的能力明显加强，与PAO1株相似。基于这些结果，Pearson等表明QS系统在PA致肺部感染的发病机理中起关键作用。在致死性方面，这项研究与本研究结果一致。　　在对抗PA感染的宿主免疫防御系统中，T细胞的免疫应答反应被认为是重要的组成部分T细胞的免疫应答反应分为Th1型和Th2型两类，Th1型反应以IFN－γ为特征性的细胞因子，IFN－γ促进lgG2a的产生，有利于与机体保护性反应的产生。Th2型反应以IL-4为特征性的细胞因子，IL-4促进IgG、IgGl的产生，提示预后不良。在CF伴有慢性PA菌肺部感染的患者，血清中IgG、IgGl抗体水平的增高往往预示着肺组织病灶中大量免疫复合物的形成，与肺部病变迁延不愈密切相关。我们的研究中，在感染的后期，与PAO-JP2组相比，PAO1组IL-4、lgG、IgGl显著升高，IFN－γ、IgG2a显著降低，而与之伴随的是PA01组病理学指数的持续较高（研究数据待发表）。因此，免疫反应可能是导致PA01组感染持续的原因之一。　　Qs系统中最为活跃的部分即为信号因子AHLS，通过合成与释放AHLS，Qs系统激活致病因子，干预机体的免疫防御系统。最近有为数不多的体内外研究显示：AHLS本身就可能是一个潜在的免疫调节因子，通过扩散出入细胞膜，直接干预机体的免疫防御系统。Smith等将30－C12HSL直接注射入小鼠皮肤，观察细胞因子的产生，结果显示，30－C12HSL能够直接诱导IFN－γ的产牛，为信号因子调节宿主免疫反应提供了体内证据。在本研究中，感染早期和中期，具有AHLS的PAOI组IFN－γ较不具有AHLS的PAO-JP2组高；在感染的晚期，PAO1组IFN－γ低于PAO-JP2组。可能的解释为：（1）PAO1组早期炎症反应较剧烈，导致了IFN－γ的明显升高；（2）AHLS本身具有免疫调节作用。　　由此可见，Qs系统一方面通过影响PA菌毒性因子的表达，引起较为严重的肺部感染；另一方面，Qs系统通过干预机体免疫系统，可能影响了肺部感染的炎症反应强度及持续时间。因而，Qs系统巾的AHL或LasR及RhlR受体，有可能成为治疗PA菌感染的新型药物的特异性靶点。密度感知系统对铜绿假单胞菌感染的免疫作用王炜芳