巨细胞病毒感染

　　【概述】

　　ｃｍｖ感染在全世界分布，人是ｃｍｖ的唯一宿主。不同国家及不同经济状况感染率不同。成人ｃｍｖ感染和免疫功能有密切关系。

　　【诊断】

　　单靠临床表现不能诊断ｃｍｖ感染，从临床标本中分离出病毒，同时抗体呈出４倍以上增加或持续抗体滴度升高，将有助于诊断。

　　一、病毒分离　最好用唾液、尿液、生殖道分泌物、乳汁和白细胞，接种到人的成纤维细胞内繁殖和分离，细胞病变效应（ｃｐｅ）在１天或数周后出现，经固定和ｈｅ染色后可观察到巨细胞，核内有内包涵体，核周晕圈及嗜酸性胞浆内包涵体，很象“猫头鹰眼”（ｏｗｌ′ｓ　ｅｙｅ）亦可用单克隆或多克隆抗体的荧光染色等方法检查。

　　二、血清抗体检测　最常用的有补体结合试验（ｃｆ）、间接免疫荧光试验（ｉｉｆ）、免疫酶试验（ｅｉａ）、间接血凝试验（ｉｈａ）和放射免疫试验（ｒｉａ）等检测ｃｍｖ－ｉｇｇ和ｉｇｍ抗体。当单份血清标本已确定既往有ｃｍｖ感染时，应当立即留血清标本，以及间隔２周、４周、８周再留血清标本，结合病毒分离可作原发感染诊断。

　　三、ｄｎａ探针　已广泛应用于检测ｃｍｖ，其中以３２ｐ标记的探针敏感性最高，对某些标本来说，杂交方法可能比病毒分离更敏感。

　　四、聚合酶链式反应（ｐｃｒ）

　　（一）标本的采集及处理　采集的标本包括患者的血液、尿，以及腺体组织等。由全血制备的血沉棕黄层（ｂｕｆｆｙ　ｃｏａｔｓ）可保存于－８０℃；尿液标本可保存于液氮中。冻存标本应避免反复冻融。　尿液标本经２５００ｒ／ｍｉｎ离心１０ｍｉｎ，以除去细胞碎片，收集上清液。由于尿液中含有ｐｃｒ抑制剂，因此需用聚乙二醇（ｐｅｇ６０００）进行预处理：５０μｌ尿上清与５０μｌ　２０％ｐｅｇ６０００和２５μｌ　２ｍｏｌ／ｌ　ｎａｃｌ混合，置冰浴中６ｈ；１５０００ｒ／ｍｉｎ离心３０ｍｉｎ收集沉淀。再于６４００ｒ／ｍｉｎ离心３ｍｉｎ；尽可能吸去上清，将沉淀悬浮于蒸馏水中。该悬液可直接用于ｐｃｒ扩增；扩增时应于１００℃加热１０ｍｉｎ，迅速置冰浴中冷却。

　　（二）模板ｄｎａ的制备

　　１。由血液标本制备模板ｄｎａ　方法ａ：向血清中加入ｎａｃｌ使最终浓度为１５０ｍｍｏｌ／ｌ；取１０μｌ　此血清于７０℃处理４５ｓ后即可直接进行ｐｃｒ扩增。

　　方法ｂ：由血沉棕黄层（ｂｃｐ）制备：①　用ｐｂｓ洗涤ｂｃｐ两次，收取沉淀。②　加入５００μｌ　　６ｍｏｌ／ｌ盐酸胍，匀浆。③　加入３０μｌ　　１０ｍｍｏｌ／ｌ　ｅｄｔａ，１０ｍｍｏｌ／ｌ　ｎａｃｌ，３０μｌ２０％　ｓａｒｃｏｓｙｌ和５μｌ　蛋白酶ｋ（１０ｍｇ／ｍｌ），混合均匀，６０℃反应１ｈ。④　加入１１３０μｌ　的乙醇，－２０℃沉淀１～２ｈ。⑤　离心收集ｄｎａ沉淀。⑥　用７０％乙醇洗两次，最后将沉淀悬浮于少量１０ｍｍｏｌ／ｌ　ｔｒｉｓ－ｈｃｌ，１ｍｍｏｌ／ｌ　ｅｄｔａ中。置４℃备用。

　　２。由冰冻组织标本制备模板ｄｎａ：①　用恒冷切片机切取一块５～１０μｍ冰冻组织块，置于１。５ｍｌ塑料管中。②　加入１０％用缓冲液配制的福马林。③　１０ｍｉｎ后离心１～２ｍｉｎ轻轻倾去上清液，沉淀用乙醇洗２次。④　于室温干燥１０～６０ｍｉｎ。⑤　加入抽提缓冲液（１００ｍｍｏｌ／ｌ　ｔｒｉｓ－ｈｃｌ，４ｍｍｏｌ／ｌ　ｅｄｔａ、ｐｈ８。０，４００μｇ／ｍｌ蛋白酶ｋ），使刚好浸没沉淀物（约５０～１００μｌ　）；将沉淀捣碎。福马林固定的或石蜡包埋组织经脱蜡和干燥后也可按此处理。⑥　３７℃放置过液。⑦　置沸水中７ｍｉｎ灭活蛋白酶ｋ。⑧　离心收集上清，取１～１０μｌ　即可进行ｐｃｒ扩增。

　　３。由尿液标本制备模板ｄｎａ：①１００μｌ　尿上清液与１００μｌ　　６ｍｏｌ／ｌ异硫氰酸胍，７μｌ　　２ｍｏｌ／ｌ　ｎａｃｌ和２０μｌ　玻璃粉悬液（ｄｎａ　ｐｒｅｐ，ａｓａｈｉ　ｇｌａｓｓ　ｃｏ，ｔｏｋｙｏ）混合。②　室温放置１０ｍｉｎ后，６４００ｒ／ｍｉｎ离心２ｍｉｎ，收集沉淀。③　沉淀用５０％乙醇，１０ｍｍｏ／ｌ　ｔｒｉｓ－ｈｃｌ、ｐｈ７.４，　５０ｍｍｏｌ／ｌ　ｎａｃｌ洗一次，６４００ｒ／ｍｉｎ离心１ｍｉｎ。④　同样洗涤沉淀２次，收集沉淀。⑤　加入５０μｌ　蒸馏水，于５５℃作用１５ｍｉｎ。⑥　１５０００ｒ／ｍｉｎ离心２ｍｉｎ，收集上清（含ｈｃｍｖ　ｄｎａ），进行ｐｃｒ扩增，将此悬液于１００℃加热１０ｍｉｎ，并迅速于冰浴中冷却。

　　（三）引物及探针　引物及探针的设计是根据已发表的ｃｍｖ的直接早期蛋白基因的启动子区和开始的４个外显子序列、晚期抗原ｇｐ６４基因以及磷酸化蛋白ｐｐ７１基因序列。常用的引物和探针列在表３中。

　　（四）ｐｃｒ扩增步骤　１。１０×反应缓冲液：１００ｍｍｏｌ／ｌ　ｔｒｉｓ－ｈｃｌ、ｐｈ８。４，５００ｍｍｏｌ／ｌ　ｋｃｌ，２５ｍｍｏｌ／ｌ　ｍｇｃｌ２，２ｍｇ／ｍｌ明胶。　ｔａｑ　ｄｎａ　聚合酶：５ｕ／μｌ。１０×ｄｎｔｐ：４种ｄｎｔｐ各２。０ｍｍｏｌ／ｌ。　引物：１００ｐｍｏｌ／ｌ。　２。常规ｐｃｒ扩增　１０×反应混合物（５０μｌ）反应缓冲液　５μｌ　１０×ｄｎｔｐ　　５μｌ　模板ｄｎａ　　５μｌ　ｔａｑ　ｄｎａ聚合酶　　０。２μｌ　（ｉｕ）　引物　各０。５μｌ　蒸馏水　３。８μｌ　加１～２滴矿物油。　将反应混合物于９４℃加热５ｍｉｎ；然后于９５℃　３０ｓ，５５℃　４０ｓ，７２℃　６０ｓ，扩增３５～４０循环。　

　　３。套式（ｎｅｓｔｅｄ）ｐｃｒ扩增：①反应混合物的组成同（２），仅引物为ｉｅ２ａ和ｉｅ４ｂ（包括了整个外显子３，共７２１ｂ），各１００ｐｍｏｌ。于９４℃　６０ｓ，５２℃１５０ｓ，７２℃　４８０ｓ，扩增２０循环。②　取２μｌ　上述扩增产物，各加１００ｐｍｏｌ的引物ｉｅ３ａ和ｉｅ３ｂ补加其他试剂。然后，于９４℃　６０ｓ，５２℃１５０ｓ，７２℃１８０ｓ，扩增２０循环。

　　（五）产物鉴定　扩增产物的分析可采用固相（滤膜）杂交和液相杂交试验。

　　１。　　固相杂交：　①预杂交液为３×ｓｓｐｅ，５×ｄｅｎｈａｒｄｔ，０。５％ｓｄｓ和２５％甲酰胺。含有扩增产物的滤膜于４２℃预杂交３０～６０ｍｉｎ。②加入标记探针（１０ｃｐｍ／μｇ，２ｎｇ／ｍｌ），杂交３０～６０ｍｉｎ。③用０.２×ｓｓｐｅ，０.０１％ｓｄｓ分别于室温洗涤滤膜３次，５ｍｉｎ／次；于６０℃洗一次，１０ｍｉｎ／次；再于室温洗一次以上，５ｍｉｎ／次。④　自显影。

　　２。　　液相杂交及电泳分析：　①取１／１０体积的扩增产物与０.５～１.０ｐｍｏｌ末端记的探针混合。②加入最终浓度为１５０ｍｍｏｌ／ｌｎａｃｌ，１０ｍｍｏｌ／ｌ磷酸钠及１ｍｍｏｌ／ｌｅｄｔａ溶液，使总体积为２０μｌ。③９５℃　１０ｍｉｎ，然后于５６℃，６０ｍｉｎ。④离心１０ｓ加入样品缓冲液，于８％聚丙烯酰胺凝胶中进行电泳。⑤电泳毕，用溴化乙锭染色，然后对ｘ线片曝光，自显影。ｈｃｍｖ　ｄｎａ分子很大，其碱基序列尚未全部搞清。虽然它的ｄｎａ的限制性内切酶片段长度具多形性，但是对其基因组的离散性还不清楚。用单一引物对进行ｐｃｒ扩增，可鉴定９０％的ｈｃｍｖ野型分离株；而采用针对不同ｈｃｍｖ序列的两套以上的引物对，则可检测几乎所有的病毒株。因此，可根据情况使用两对或两对以上的位于基因组不同区域的引物进行ｐｃｒ检测。

　　在ｈｃｍｖ模板ｄｎａ制备过程中，有时会产生一些小片段ｄｎａ，在ｐｃｒ反应时常导致一定水平的本底产物，从而影响对结果的判定。在这种情况下可采用套式ｐｃｒ法，其基本原理就是靶ｄｎａ的扩增分为两步：首先利用一对引物，扩增包括靶ｄｎａ在内的长片段ｄｎａ；然后取少量的扩增产物，利用只针对靶ｄｎａ的引物再进行第二次扩增。

　　通过控制每步中的扩增循环数，即可防止由小片段ｄｎａ引起的假阳性。这种方法也可避免产生假阴性结果。　ｐｃｒ检测ｈｃｍｖ标本具有很高的敏感性。从ｈｃｍｖ感染的组织培养上清可检测到相当于几十个病毒的ｄｎａ分子或１～５ｐｆｕ病毒的ｄｎａ序列。用非放射性寡核苷酸探针进行ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交分析扩增产物，可从尿液标本中检测到１ｐｇｈｃｍｖ　ｄｎａ序列的水平；利用该系统，在４×１０４个细胞中只有一个病毒基因组即可检测出，较斑点印迹杂交提高２×１０３倍。ｐｃｒ技术对ｈｃｍｖ感染的检测具有临床应用价值，因为体液中病毒ｄｎａ先于病毒感染的临床症状或血清学证据的出现，可作为ｈｃｍｖ感染的早期指标。由于ｈｃｍｖ可通过胎盘内感染、产道感染等途径传播，而且受感染的新生儿死亡率较高，因此利用ｐｃｒ进行早期诊断及采取及时的治疗措施，对优生优育也有重要意义。利用这种方法，还可鉴定器官或组织移植手术中供体是否为ｈｃｍｖ与许多严重病症的关系。再者，ｐｃｒ检测指标稳定，还可进行半定量分析，因此可作为评价各种抗病毒药物疗效的手段。

　　【治疗措施】

　　巨细胞病毒感染的治疗，可应用各种抗病毒制剂如ｇｃｖ、抗巨细胞病毒的免疫球蛋白制剂、干扰素及转移因子等。但这些药物并不能解决根本问题，往往停药后病毒又潜伏地回升，鉴于此种病毒可能作为艾滋病的病因之一，各国学者均在致力于控制其感染的研究。最近，美国学者研制出两种活疫苗，初试后颇见效。一种是由ａｄ１６９菌株研制成的；另一种是从ｔｏｗｎ菌株制成的，经非肠道给药后，已明显表现出有抗巨细胞病毒的效能，ｃｍｖ抗体升高，导致免疫功能增强。

　　【病原学】

　　ｃｍｖ属于疱疹病毒群，是人类疱疹病毒组中最大的一种病毒，其形最大由１６２个壳粒（ｃａｐｓｏｍｅｒ），正２０面体构成。有典型的疱疹病毒结构。ｃｍｖ只能在人纤维母细胞培养中增殖，而不能在其他动物细胞中生长，增殖非常缓慢，初次分离需一个多月才能出现特殊的细胞；细胞变园，膨胀，细胞及核巨大化，核周围出现一轮“晕”的大型嗜酸性包涵体。ｃｍｖ在２０％乙醚中最多存活２小时。ｐｈ＜５时，或置于５６℃３０分钟，或紫外线照射５分钟可被充分灭活。ｃｍｖ的感染性对冻融或存于－２０℃或－５０℃均不稳定，１０％的家用漂白粉可使其感染性明显降低。

　　【发病机理】

　　ｃｍｖ感染可引起机体的免疫功能降低，特别是细胞免疫功能下降。ｃｍｖ感染对胸腺发育及脾细胞、单核吞噬细胞、ｎｋ细胞及ｃｔｌ细胞的功能有着显着的影响。

　　一、对胸腺、脾脏的影响　实验室急性ｃｍｖ感染的新生豚鼠，胸腺发育受抑，ｔ细胞数减少，成年鼠感染ｃｍｖ后，８８％胸腺可检出ｃｍｖ。ｃｍｖ感染致脾功能受影响，脾脏淋巴细胞对ｃｏｎａ刺激的增殖下降，脾细胞产生的ｉｌ－２显着降低。

　　二、对免疫细胞的影响ｃｍｖ感染引起的免疫抑制与病毒在细胞内的复制有关。ｃｍｖ可以在单核吞噬细胞、ｔ细胞、ｂ细胞及一些尚未确定的单核细胞中复制，其中单核吞噬细胞最易感染ｃｍｖ，淋巴细胞在免疫反应中具有重要的调节功能和效应功能。ｃｍｖ感染后，可引起淋巴细胞的多种免疫功能受损。

　　ｃｍｖ感染多表现为急性单核细胞增多症。外周血淋巴细胞对有丝分裂原、ｃｍｖ抗原和ｈｓｖ抗原增殖反应减弱，诱导干扰素水平下降，ｃｄ４／ｃｄ８比值从１.７±０.７下降为０.２＋０.２，ｔ细胞活性降低。这种变化有的可持续相当长时间，病后１０个月，大多数患者ｔ细胞亚群比例仍未完全恢复正常。

　　ｃｍｖ感染的免疫抑制作用主要是被病毒感染的大单核细胞和ｃｄ８细胞的功能异常所致。单核吞噬细胞在抗ｃｍｖ免疫中起着枢纽作用，不但可以直接吞噬、杀伤病毒，更重要的是可以处理、提呈抗原，分泌细胞因子，调控和扩大免疫反应。当ｃｍｖ感染后，单核吞噬细胞功能受到影响，ｃｍｖ感染巨噬细胞引起其吞噬功能降低，细胞内氧自由基产生减少，ｆｃ受体、补体受体的表达发生改变，且其抗原提呈功能降低，产生ｉｌ－１降低，对ｉｌ－１及ｉｌ－２的反应亦降低。ｍｏｓｅｓ等用胸腺细胞增殖试验检测，ｉｌ－１活性降低，ｉｌ－１产生降低可引起ｔｈ／ｔｓ细胞比例失衡。

　　ｎｋ细胞有拮抗ｃｍｖ扩散的作用。ｎｋ细胞积极参与了抗ｃｍｖ感染的全过程，但存在高的ｎｋ活力不一定是保护性应答，而是活动性感染的证明。ｎｋ细胞虽不能阻止原发性ｃｍｖ感染的出现，但一旦存在感染后，ｎｋ细胞能在ｃｍｖ感染早期出现，有限制扩散、使感染局限的作用。ｎｋ细胞、ｃｔｌ细胞是抗ｃｍｖ的重要效应细胞。在ｃｍｖ复制早期，感染性病毒体产生前，它们能裂解感染细胞，使病毒在细胞间扩散流产。在小鼠模型中，病毒作用了３－５天时，抗病毒效应由ｎｋ细胞介导，ｎｋ细胞活性可由ｉｆｎ增强。６－２１天，脾、外周血存在ｃｔｌ细胞的杀伤活性。ｎｋ细胞、ｃｔｌ细胞活性的高低决定了机体对ｃｍｖ感染的敏感性及感染恢复的难易性。但ｃｍｖ感染时，ｎｋ细胞及ｃｔｌ细胞活性亦受到严重影响。此外，特异性细胞免疫有阻止ｃｍｖ感染再发作用。有人检测了２０个发生ｃｍｖ感染肾移植受者ｔ细胞应答，发现有１４个有ｃｍｖ细胞毒应答，而６个不出现细胞毒应答者有严重的临床后果。因此，特异性ｔ细胞存在，有阻止ｃｍｖ感染再发的作用。

　　三、抗体有降低ｃｍｖ感染的毒力作用　机体受ｃｍｖ的感染后，可出现多种抗体。乳汁、宫颈分泌物、唾液中尽管有特异性抗体出现，包括中和抗体。但仍能检出ｃｍｖ，说明抗体并不能阻止病毒扩散。胎儿从母体被动获得的抗体不能阻断经宫内、产道或乳汁传播的感染。研究证明，致死性ｃｍｖ攻击前，在小鼠腹腔或静脉注入０.２ｍｌ高效价抗ｃｍｖ球蛋白，可完全保护动物免于死亡。１个月后再用ｃｍｖ等二次攻击，动物仍全部存活，表明抗体有降低ｃｍｖ的毒力作用。

　　初次感染后，ｃｍｖ将在宿主细胞中无限期存在成潜伏状态。可能累及多种组织器官，尸检提示肺、肝、胰、唾液腺、中枢神经系统及肠也可能是病毒潜伏场所。先天性感染的严重程度，与缺乏产生沉淀抗体的能力和ｔ细胞对ｃｍｖ的应答有关。儿童和成年人感染ｃｍｖ后，在外周血中出现具有抑制细胞毒表型的活化ｔ淋巴细胞，如果宿主的ｔ细胞功能受损，潜伏的病毒就可能复活并引起多种症候群。组织移植后发生的慢性刺激，为ｃｍｖ活化，诱发疾病提供了条件。某些针对ｔ细胞的强烈免疫抑制剂如抗胸腺细胞球蛋白，与临床ｃｍｖ症候群高发率有关。此外，ｃｍｖ在功能上可作为辅助因子，使潜伏感染的ｈｉｖ活化。