巨细胞病毒感染的检查

人巨细胞病毒（HcMV）在人群中广泛存在，用测定HCMV―IgG，HcMV―IgM的方法调查HcMV感染率，发达国家为40％～60％，发展中国家为95％～100％。HcMv感染所致疾病的临床症状和体征等表现是非特异性的，而且许多HCMV感染的病人并不表现出任何临床症状而成为潜在感染状态。健康人群感染HcMV后，一般表现为轻微症状或无症状感染，但在免疫功能低下的人群，如器官移植，艾滋病，肿瘤病人，婴幼儿则可导致严重后果；早孕妇女感染HCMV，可通过胎盘引起胎儿宫内感染，从而导致流产、早产、死胎、胎儿宫内发育迟缓和新生儿先天畸形等。因而HcMV感染是一个值得重视的问题。近年来，HcMv实验室诊断在原有的实验方法基础上，主要在早期，快速和定量方面进行大量研究。目前，HCMv实验室诊断方法主要有以下几个方面。（一）检查巨细胞包涵体在患者新鲜尿液，活检组织或尸检标本切片寻找巨细胞包涵体；此法现已弃之不用。（二）HCMV组织培养方法①培养基：RPMI1640液，加入20％小牛血清，即常用的细胞培养液。②实验用细胞系：HDEL．即人二倍体胚肺细胞系。③实验标本：精液、尿、血液、胸水、腹水、支气管灌洗液、脑脊液等，均可用于本试验。{生殖就医指南网（www.９１zn.cn.是你知心的朋友}④操作方法（以尿为例，其他类同）：将HDEL细胞系培养于含20％-小牛血清的RPMll640液中，待HDEL细胞系长成细胞单层后，将病人新鲜尿液，经处理后（高速离心沉淀）接种人胚肺纤维母细胞，定期观察细胞病变（CPE）情况。如有CPE产生，证明原培养物中HcMV阳性；10d后，若无cPE，将细胞盲传一次，仍无cPE，可报告HcMv培养阴性。⑤报告结果：尿液（或其他标本）HCMv培养阳性（或阴性）。（三）HCMV抗体检测HcMV抗体检测的方法较多，包括补体结合试验（CF）、间接血凝试验（IHA）、免疫荧光试验（IFA）、免疫印迹试验（IB）、酶联免疫吸附试验（ELISA）及放射免疫试验（RIA）等。其中ELISA和RIA具有简便、快速、敏感性好和特异性强等特点，是较为常用的检测方法。目前市售的ELISA测定HcMV一IgG和HcMV―IgM试剂盒，是HcMV抗体检测最简便的方法。应该注意的是，HcMV―IgG抗体阳性，仅能说明患者有既往感染（或称原发性感染）史，HcMv一IgM阳性则表明有活动性感染。两种抗体同时测定，有助于判定患者HcMv感染及活动状况。现以EL[SA法为例，介绍HcMV―IgG，IgM抗体的测定方法。（1）试剂HcMV一IgG，IgM抗体的测定试剂盒，购于深圳晶美生物工程有限公司。试剂盒组成：进口纯化抗原包被的酶标板条，12（条）×8（孔）；强阳性对照血清1瓶（1mL）；弱阳性对照血清1瓶（1mL）；阴性对照血清1瓶（1mL）；标本稀释液1瓶（20mL）；酶联物1瓶（酶标记抗人IgG，1mL，lO×）；底物A1瓶（6mL）；底物Bl瓶（6mL）；反应终止液1瓶（6mL）；浓缩洗涤液1瓶（25mL，20×）。（2）标本收集不能使用溶血，混浊或脂血标本；最好使用新鲜标本，如需保存，可于2～8℃冷藏48h或于一20％：冷冻4周。（3）试验步骤①配制洗涤液：1瓶浓缩洗涤液加475mL蒸馏水，配好的洗涤液短期内可置室温，长期可存放于4℃。②待试剂盒平衡至室温后，待测标本用标本稀释液按1：20l稀释，即取1uL血清加200uL标本稀释液混合。③各加100uL强阳性，弱阳性，阴性对照及已稀释待测标本上清液于相应孔内，空白对照孔加100uL标本稀释液，盖好反应板，37℃孵育30min。④甩尽板内液体，每孔用200～300uL洗涤液洗5次，每次均需拍干。⑤按一次用量吸取浓缩酶联物，以标本稀释液按1：10稀释，每孔加稀释酶联物100uL（或2滴），盖好反应板，37℃孵育30min。⑥甩尽板内液体，每孔用200～300uL洗涤液洗5次，每次均需拍干。⑦加底物A及B各50uL（或1滴），混匀，37℃15min。⑧每孔加终止液50uL，用酶标仪450nm测其OD值，若肉眼观察则不加终止液，判断结果。（4）结果判断①阴性对照平均OD值须小于0．2。②弱阳性对照平均OD值须在0．20～0．65之间。③弱阳性对照与阴性对照平均0D值之比须大于或等于2，符合以上三种条件，本次实验结果可信，否则重复试验。④若待测标本孔显色比弱阳性对照孔深则判为阳性，反之为阴性。但在弱阳性对照上下10％范围内最好再测一次，如确实高于弱阳性对照，则可判为阳性。HCMV―IgM抗体测定，方法同HCMV―IgG。（四）HCMlV抗原的测定HCM：V抗原组成非常复杂，有数十种之多。一般认为，患者原发性感染的早期所表达的蛋白为HcMV的即刻早期抗原，继发性感染表达的多为：HCMV的晚期抗原，因此，可用单克隆抗体来鉴别患者血清中的病毒抗原成分。以判定患者为原发性感染或继发性感染。这对于某些病人，如早孕妇女，因为能判定其为原发性还是继发性感染，对于判定胎儿的损伤程度有一定的临床意义。（1）HCMV早期抗原的免疫荧光检查（detectionofearlyantigen：fluorescentfoci，1）EAFF）此法是在传统的细胞培养的基础上发展起来的。细胞培养虽然是HcMv诊断经典的方法，但此法费时，费力，敏感性低，不利于HcMV的早期快速诊断。DEAFF法通过测定HcMvDNA合成前产生的早期抗原（EA）来确定HCMV存在与否。方法为：将待测标本接种到人胚肺纤维母细胞单层上，培养24h后用荧光素标记的鼠抗HCMV单克隆抗体，直接测定HcMv感染的a和β蛋白。试剂：培养基，RPMI1640液，加入20％小牛血清。实验用细胞系HDEL，即人二倍体胚肺细胞系。实验用标本同HcMV组织培养法。操作方法：（以尿为例，其他类同）将HDEL细胞系培养于含20％小牛血清的RPMI1640液中，在培养皿中放入特制的小盖玻片，待HI）EL细胞系长成细胞单层后，将病人新鲜尿液，经处理后（高速离心沉淀）接种人胚肺纤维母细胞，24h后将玻片取出，用无血清RPMI1640液洗3次，直接加入荧光素标记的小鼠抗HCMV早期抗原的McAh，37℃30min，洗片后直接用荧光显微镜观察结果。出现荧光颗粒为HCMv早期抗原阳性。报告结果尿液（或其他标本）HCMV早期抗原阳性（或阴性）。（2）白细胞中HCMV抗原测定这是一种直接诊断活动性HcMV感染的方法。将白细胞固定在玻片上，加入HCMV单克隆抗体（抗PP65）温育后，加入荧光素标记的羊抗小鼠抗体（二抗），洗片后可直接用荧光显微镜观察结果。也可用辣根过氧化物酶（HRt，）标记的羊抗小鼠抗体染色后，加入底物显色，2mol／L硫酸终止反应后用光学显微镜观察结果。凡细胞中有显荧光颗粒（荧光法）或棕黄色颗粒的，即为阳性细胞。操作方法及判定结果同上。（五）HCMVDNA的PCR测定方法PCR技术是近10年来发展起来的分子生物学领域中新一代检测技术，自1985年Saiki等首次报道以来，此技术迅速发展，出现了多种用途的PcR，如竞争PcR，差异PCR，不对称PCR，固定化PCR，加端PcR，原位PcR，免疫PCR，锚定PCR，重组PCR和定量PCR等。．HCMV的PCR测定，可用单次PcR和套式PCR，单次PCR可检出100f的HcMVDNA，而套式PCR可检出5～10的HcMVDNA。PCR检测技术具有简便，快速，敏感及特异等特点，对检测标本要求不高且较为广泛，几乎包括所有临床标本，如血液、尿液、精液、支气管洗液、羊水及石蜡包埋的标本均可用于PCR测定。1．引物的选择应用PcR进行HcMVDNA检测，首要的问题是引物的选择与设计。HCMvDNA在结构上含有三种感染细胞特异性多肽的区段，即刻早期蛋白区（IEP），早期蛋白区（EP）和晚期蛋白区（LP）。这三种多肽均有免疫原性。在进行HCMVPCR时，引物的设计应考虑到这类不同抗原的编码基因。选取哪一段作为引物可根据不同的情况而定，应注意的是引物所位于的区域为病毒较特异的序列，即该序列为其所特有，而且又存在于不同的突变株，以便检测不同的突变株，以保证DNA序列扩增的特异性及实用性。因此，一般引物均设计在HCMv特异的保守序列。Demmler等设计的位于900―925nt及2101～2125nt的一对引物，其序列为：p1：5’一CACCTGTCACCGCTGCTATATTTGC一3’p2：5’一CACCACGCAGCGG（：CCTrGATGTTT一3’应用该对引物扩增HcMV可产生一条长约400个bp、含HindⅢ切点的．DNA片段、该序列编码HCMV的晚期抗原蛋白。2．标本处理精液、血清、尿液等液体标本可直接用苯酚一氯仿抽提，用酒精沉淀，蒸馏水溶解后用于PCR扩增，组织标本需绞碎，水溶后再用上法提取（详细方法请参阅聚合酶链反应一节）。3．PCR扩增（1）取5～10uL提取检样或其他模板DNA溶液，加入10×PCR缓冲液10uL，使最终反应液中含50mmol／LKCl，10mmol／LTris―HCl（pH8．4），1．5mmol／LMgCl2及0．01％明胶；（2）两种引物各2uL（60uL／uL；（3）加入dNTPl0uL（最终为0．2mmol／L）；（4）加高纯水，使反应体积为100uL；（5）将反应液100℃煮沸10min，加入2uTaqDNA聚合酶及50taI．液体石蜡油以防蒸发；（6）94℃1min，55℃1min，70℃1．5min，循环40次；（7）扩增产物的电泳分析：20uL扩增产物加入l／10体积的终止缓冲液，在l％琼脂糖一溴乙锭电泳后在紫外灯下观察结果，此法可测出原检样中0．15fg的HCMvDNA。