口腔癌中人乳头瘤病毒16型和Ha

材料和方法　　1.标本：17例口腔鳞状细胞癌标本，来自湖北医科大学口腔医院手术切除或活检标本，均经病理确诊。　　2.组织DNA的提取：将组织剪碎、匀浆后，用蛋白酶K消化，苯酚、氯仿抽提，RNA酶纯化。紫外分光光度计测定DNA溶液的含量。按常规方法制备HPV16及突变型（G→T）Ha-ras癌基因质粒DNA。　　3.多聚酶链反应（PCR）：扩增HPV16上游调节区（URR）片段的两个引物，其序列为：HPV16-1:5′-GCTGTTAGGCACATATTTT-3′HPV16-2:5′－ATGAACTAGGGTGACATTT-3′扩增Ha-ras癌基因片段的两个引物，其序列为：Ha-ras-a:5′-ACGGAATATAAGCTGGTGG-3′Ha-ras-2:5′-CGGCGGCAGGTCCACGGTC-3′　　引物由中国科学院上海细胞生物研究所合成。　　按标准各配制HPV16和Ha-ras癌基因的PCR反应体系50μl，94℃变性10分钟，55℃水浴2分钟，加入2单位TaqDNA聚合酶，覆盖30μl石蜡油，离心数秒，72℃水浴30秒。再以94℃60秒，55℃30秒，72℃30秒循环35次，最后一次循环在72℃保温10分钟，取PCR产物10μl在2％琼脂糖凝胶上电泳，溴化乙锭染色，紫外灯下观察DNA扩增带。　　4.限制性片段长度多态性分析（restrictionfragmentlengthpolymorphism,RFLP）：取Ha-rasPCR产物下层水相20μl，用等体积氯仿抽提，沉淀，抽干。加入酶切缓冲液3μl，双蒸水26μl，HpaⅡ10u,37℃保温4小时，用0.5MEDTA2μl终止反应，10％聚丙烯酰胺凝胶电泳，观察电泳片段。

结　　果　　1.口腔癌中HPV16DNA和Ha-ras癌基因点突变的检测结果：　　分别以HPV16质粒DNA和突变型Ha-ras癌基因质粒DNA作为阳性对照，以双蒸水作为阴性对照。口腔癌组织经过HPV16DNA扩增电泳后，若在100bp处出现DNA特异性的染色带，说明HPV16DNA检测结果为阳性。经过Ha-ras癌基因扩增，HpaⅡ酶切电泳后，若在138bp处出现一条DNA扩增带，说明Ha-ras癌基因第12位密码子发生点突变。结果显示，在17例口腔癌组织中，6例（35.3％）组织HPV16DNA阳性，5例（29.4％）组织Ha-ras癌基因发生突变，其中2例组织HPV16DNA和Ha-ras癌基因点突变的检测均为阳性。　　2.口腔癌的分化程度和HPV16DNA及Ha-ras癌基因点突变的关系（表1）。

表1　口腔癌分化程度和HPV16及Ha-ras点突变分化程度例数HPV16阳性数点突变阳性数高421中622低722合计1765

　*P>0.05讨　　论　　运用核酸杂交和PCR技术，近年来已在口腔癌中发现不同类型和不同阳性率的HPVDNA，包括HPV2、3、6、11、16、18和57型，以HPV16的检出率最高［1，2］。Watts在14例口腔鳞癌组织中，发现所有组织HPVDNA为阳性，其中11例为HPV16，2例为HPV18，1例为HPV6，7例为HPV11［3］。本文检测17例口腔癌组织中的HPV16DNA，其阳性率为35.3％，结果提示HPV16可能与口腔癌之间存在一定的关系。分析口腔癌的分化程度与HPV16感染之间的关系，未发现它们之间的差异性（P＞0.05），和Maitland的报道［4］一致。目前已证实HPV的高危型（主要是HPV16，18）与宫颈癌的发生密切相关。HPV16可引起多种细胞株的转化，其E6、E7基因的表达与恶性表型的诱发和维持有关。但要证实其在口腔癌中的作用还需要大量的证据。本新闻共2页,当前在第1页12bjh华夏口腔网