己酮可可碱对大鼠溃疡性结肠炎治疗作用及其机制

　　【摘要】目的：观察己酮可可碱（PTX）对大鼠溃疡性结肠炎（UC）模型的治疗作用，探讨血栓及血栓前状态（PTS）在溃疡性结肠炎发病中的作用和己酮可可碱作用机制。方法：用2，4，6三硝基苯磺酸（TNBS）造大鼠溃疡性结肠炎模型，将大鼠模型随机分为模型组，模型+生理盐水组，模型+己酮可可碱组，另设空白对照组，共4组。观察各组大鼠肠道大体形态和组织学改变；采用血小板黏附仪检测血小板黏附功能（PAdT），智能血液凝聚仪检测血小板的聚集功能（PAgT）；ELISA法测定血清中的血栓烷B2（TXB2）；单克隆酶联吸附法检测血管性假血友病因子相关抗原（vWF∶Ag）；酶联免疫吸附法检测细胞内粘附因子1（ICAM1）。结果：与模型+生理盐水组比较，模型+己酮可可碱组损伤指数下降（6.02±0.74vs0.85±0.50，P<0.01；5.68±0.60vs1.08±0.45，P<0.01）；模型组血小板黏附率和聚集率与空白对照组无明显增加（P>0.05）；模型组TXB2，vWF∶Ag，ICAM1均较空白对照组的差异无统计学意义（P<0.01），经己酮可可碱治疗后，均较模型+生理盐水组降低（P<0.05）。结论：TNBS所诱导大鼠溃疡性结肠炎模型与PTS有一定关系。PTX通过抗凝、抗炎症介质、抗细胞因子而发挥治疗UC作用。

　　【关键词】己酮可可碱；结肠炎，溃疡性；血小板功能试验；炎症介质；细胞因子

　　溃疡性结肠炎（ulcerativecolitis，UC）发病机制尚未明确，在活动期肠粘膜呈弥漫性充血水肿，且有出血点、溃疡存在。UC与血栓及血栓前状态有密切的关系，并应用肝素治疗取得一定疗效［1-2］。抗凝常用药己酮可可碱毒副作用小，使用安全，有抗血小板、抗脂质过氧化、免疫抑制作用等，因此可能对UC具有一定的抗炎作用。本研究旨在探讨己酮可可碱对大鼠溃疡性结肠炎模型的治疗作用及其作用机理。

　　1材料和方法

　　1.1材料

　　健康SD大鼠（由上海实验动物中心提供）60只，雄性，体质量150～200g，正常喂养；2，4，6三硝基苯磺酸（TNBS）为Sigma公司产品，血管性假血友病因子相关抗原（vWF∶Ag），血栓烷B2（TXB2）检测试剂盒，由苏州大学医学院血栓与止血研究室提供；细胞内粘附分子1（ICAM1）试剂盒购自华美公司。SH293智能血液凝聚仪（购自上海生化仪器厂），血小板粘附两用仪（无锡电子仪器二厂产）；己酮可可碱（PTX）（上海第十六制药厂提供）。

　　1.2方法

　　1.2.1动物分组及处理

　　将60只大鼠随机分为正常对照组（简称N组），模型组（简称M组），模型+生理盐水组（简称NS组），模型+己酮可可碱组（简称PTX组）。正常对照组、模型组各20只，其余每组10只。正常对照组不作任何处理。

　　1.2.2大鼠UC模型的建立及处理

　　SD大鼠术前禁食24h，自由饮水，实验时乙醚麻醉，用一直径2.0mm，长约12cm的硅胶管由肛门轻缓插入深约8cm，实验各组以含150mg/kgTNBS的等体积乙醇溶液0.5mL缓慢注入结肠，让动物保持平躺，自然清醒。模型造成后（第4日），N组、M组各随机选10只大鼠，禁食两天后断颈处死，处死前穿刺心脏取血，每只约2~3mL，冻存备用，所剩10只正常喂养。NS组以生理盐水2mL/次，PTX组按8mg/kg（溶解于2mL生理盐水中）灌胃，2次/d.3wk各组大鼠全部处死，处死前穿刺心脏取血，每只约2~3mL，冻存备用。所有处死大鼠，剖取远端结肠8cm，沿纵轴切开，生理盐水迅速冲净，置于标本体积10倍以上的甲醛溶液中固定。

　　1.2.3结肠粘膜损伤评分

　　大体形态评分：将福尔马林固定后的结肠标本肠粘膜层向上平铺于硬纸板上，用大头针固定，并保持在生理盐水中，用放大镜观察粘膜急性损伤程度，并按下列标准评分：0分：无损伤；1分：局部充血、水肿但未出现溃疡；2分：有溃疡，但没有明显炎症；3分：有溃疡，仅有一处出现炎症；4分：有多处溃疡和炎症，溃疡大小<1cm；5分：有多处溃疡和炎症：至少有一处溃疡大小>1cm.组织学损伤评分：包括溃疡炎症肉芽肿、纤维化，按有无及轻重计为0，1，2分，病变深度（达粘膜下层1分，肌层2分，浆膜层3分）各项相加得总分。

　　1.2.4血清指标检测方法

　　采用ELISA法检测TXB2，单克隆酶联吸附法检测vWF∶Ag，酶联免疫吸附法检测ICAM1（均按试剂盒说明）。血小板粘附两用仪检测血小板粘附功能（PAdT），32g/L枸橼酸钠按1∶9抗凝；用SH293智能血液凝聚仪检测血小板的聚集功能（PAgT），用2μmol/L二磷酸腺苷作诱导剂，测定最大聚集率。

　　统计学处理：实验结果以x±s表示，采用SPSS10.0软件包进行方差分析及多重比较。

　　2.1一般情况

　　大鼠造模型1d后，开始逐渐出现懒动、拱背、厌食、大便次数增多、软便或稀便、大便末端有粘液或脓点等表现。3d后症状达到高峰，大鼠毛色无华、变脆，嗜卧扎堆，大便完全为稀便，带脓血。N组大鼠无腹泻、懒动等异常改变。

　　2.2肠组织大体形态

　　造模型3d后，M组处死大鼠结肠标本表现为黏膜充血、水肿、溃疡形成，结肠组织与周围组织粘连。而N组结肠标本粘膜光滑，无溃疡，腺体排列整齐（图1A，B）。

　　2.3PTX对大鼠溃疡性结肠炎大体形态及组织学损伤的影响M组组大鼠结肠标本表现为黏膜充血、水肿、溃疡形成，结肠组织与周围组织粘连，可见近端肠腔扩张。溃疡呈线状和灶状，周围可见黏膜增厚、肠腔狭窄。光镜下可见溃疡及炎性渗出物，可见上皮细胞坏死、脱落，有淋巴组织增生，大量中性粒细胞浸润，可见数量不等的单个核细胞和嗜酸性粒细胞，也可见增生的纤维母细胞。PTX组黏膜水肿少见，无溃疡和炎性渗出物，光镜下腺体排列整齐，仅见少量淋巴细胞和中性粒细胞浸润，损伤指数低于模型组及生理盐水组（P<0.01，表1，图2A，B）。表1各组大鼠结肠大体形态和组织学损伤评分比较（略）

　　2.4血小板黏附功能、聚集功能的变化

　　造模3dN组和M的PadT，PagT差异无统计学意义（P>0.05）。3wk后，N组和M组的PAdT，PAgT有统计学差异（P<0.05），模型组增高；经不同干预，NS组血小板黏附功能、聚集功能明显增高，而PTX组无统计学变化，两组比较有统计学差异（P<0.05，表2）。A：生理盐水处理组；B：己酮可可碱处理组。表2大鼠溃疡性结肠炎血小板黏附功能、聚集功能及PTX的影响（略）

　　2.5大鼠溃疡性结肠炎TXB2，vWF∶Ag及ICAM1含量变化造模3dM组（3d）的TXB2，vWF∶Ag及ICAM1含量较N组（3d）增高；3wk后，M组3项指标的增加量更大，经不同干预，PTX组较NS组明显降低（表3）。表3大鼠溃疡性结肠炎TXB2，vWF∶Ag及ICAM1含量变化及PTX的影响（略）

　　临床研究发现，UC患者活动期肠粘膜呈弥漫性充血水肿，且有出血点，肠系膜血管可出现多灶性的微梗死，发生血小板栓塞性疾病的概率比正常人高，这可能与患者体内血小板处于激活状态密切相关［3］。传统上认为炎症与血栓形成是两个互相独立的病理过程。近来研究发现［4］炎症与血栓形成之间存在着密切的联系，现已公认体内炎症凝血之间存在网络关系。本实验采用TNBS灌肠造UC模型的方法，造模3d随机处死模型组和正常对照组大鼠各10只，检测大鼠血清血小板黏附率和聚集率，结果显示两组之间无明显差异；而检测标志血小板活化大鼠血清TXB2，vWF∶Ag含量，两组则有统计学差异。UC发病过程，血小板不仅参与血栓形成，其作为炎症细胞可直接引起炎症反应。活化的血小板可释放多种炎症介质，如血栓素、血小板活化因子等。TXB2，vWF∶Ag含量增高，既标志血小板活化，又代表脂质炎症介质的产生，引起炎症反应，导致组织损伤。之所以造模初期血小板黏附率和聚集率无明显变化，分析认为，可能与造模初期血小板未被完全激活，尚不能影响血小板黏附率和聚集率有关。

　　本研究应用己酮可可碱干预UC大鼠模型，其作用明显优于生理盐水模型组，大鼠结肠大体形态和组织学损伤评分，PTX组和NS组比较有显著性差异。己酮可可碱主要作用是抑制血小板聚集，进而可减少血小板之间以及血管内皮的粘附与聚集，能改善高凝状态抑制血栓形成。同时抑制血小板活化可减少脂质炎症介质的产生从而阻止组织细胞损伤［5-6］。PTX可以降低中性粒细胞（PMN）的粘附聚集能力，抑制PMN的膜补体C3受体的表达，起到免疫抑制作用［7］。本实验显示，己酮可可碱可明显抑制大鼠血清血小板黏附率和聚集率，降低大鼠血清TXB2，vWF∶Ag和ICAM1含量。认为己酮可可碱可通过抗凝、抗炎症介质、抗炎症免疫而达到治疗UC作用。

　　【参考文献】［1］WebberleyMJ，HartMT，MelikianV.ThromboembolismininflammatorybowelDisease：Roleofplatelets［J］。Gut，1993，34：247-251.

　　［2］贺国斌，欧阳钦，陈岱云，等。溃疡性结肠炎结肠组织微血栓形成的研究［J］。中国内镜杂志，2003，9（7）：34-36.

　　［3］魏艳静，卞红磊，武会珍。溃疡性结肠炎患者体内血小板功能状态研究［J］。临床荟萃，2003，18（11）：608-609.