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莱姆病初步调查
姜理平1莫世华1郑寿贵2孟真1程苏云1谢淑云1叶晓东2
摘要:目的为了解浙江省莱姆病流行状况及特点。方法：应用间接免疫荧光法（IFA）检测了148名山区农民抗莱姆病抗体IgG水平，并对蜱叮咬史是否有关节痛进行问卷调查，并进行了传播媒介、传播媒介中是否带有莱姆病DNA片段进行调查。结果，148名山区农民中，抗莱姆病抗体IgG阳性率4.05%。传播媒介中分别在微小牛蜱和长角血蜱中检测到莱姆病DNA片段，阳性率为1.3%。结论：山区农民中存在莱姆病感染，具有相关症状，应注意早期发现和治疗。
关键词：山区农民莱姆病感染IgG抗体
JIANGLi-ping1,MOShi-hua1,ZHENGShou-gui2,MENGZhen1,CHENSu-yun1,XIEShu-yun1,YEXiao-dong2（ZhejiangprovincialCenterforDiseaseControlandPrevention,Hangzhou310009,China）
PriliminaryInvestigationonLymeDiseaseinZhejiangProvince
Abstract:[Objective]ToinvestigatetheepidemiologicalcharacterizationofLymediseaseinZhejiangprovince.[Methods]Questionnaireabouttick-biteandarthralgiahavebeendone.IndirectimmunofluorescentantibodytechnologywasusedforIgGdetectionof148serafrompeasantinmountainarea.PolymerasechainreactionwasusedtodetectedBorreliaDNAintick.[Results]PositiverateoflymediseaseIgGdetectedin148serawas4.05%.BorreliaDNAwereidentifiedintickHa.formosensisandmicroplus.Positiveratewas1.3%.[Conlusion]Therearesomesymptomsrelatedtolymediseaseinfectedinpeasantinmountainarea.Diagnosisandtreatmentshouldbeentakenatearlystage.
Keyword:peasantinmountainarea;BorreliaDNA;IgG
莱姆病（LD）是一种多系统和多阶段感染，由蜱传播螺旋体（Borreliaburgdorferisensulato）所引起，有B．burgdoereriscnsustricto（北美和西欧）、B．afzelii（西欧中欧和俄罗斯）和B．garinii（欧洲、俄罗斯和北亚）3个基因种。与所有的螺旋体感染一样，LD的疾病发生按不同的阶段进行，并可侵犯许多组织和脏器，包括皮肤、关节、心脏和神经系统。早期感染（第1期）为原发移动红斑（EM），即在蜱叮咬后的数日至数周内出现环状
皮疹。以后数日至数周内螺旋体的血源性扩散（第2期）导致多发性
皮肤病变（续发EM），以及
脑膜炎、神经根
神经炎、房室阻滞、心肌炎和单关节关节炎。持续性感染（第3期）发生于原始接触数月至数年以后，并与慢性萎缩肢皮炎、不同程度的脑病和脑脊髓病以及持续性关节炎有关。现在已有30多个国家报告发现有莱姆病存在，且发病区域和发病率呈迅速扩大和上升趋势。已证实在我国莱姆病分布相当广泛，临床表现复杂多样，对人群健康危害严重，已成为我国一种相当重要媒介传染病。我省临近省份福建省也检到莱姆病DNA片段为此我们选择了金华市金东区进行调查，金东区位置浙江省中部偏西，属亚热带季风气候，适合于蜱的生长。
材料和方法
一、标本采集
1、共148份人血清，均系居住于金东区农民，在对关节疼痛史、蜱虫叮咬进行问卷后，常规静脉取血2-3ml，分离血清，-30℃保存待测。
2、在牛犬身上采集寄生蜱，并用旗布法采集游离蜱，进行蜱种鉴定后，进行DNA提取后，进行PCR扩增。
二、检测方法
1、间接免疫荧光（IFA）检测莱姆病螺旋体抗体。
莱姆病抗原片购自中国疾病预防控检测中心
羊抗人IgG由本室自制。
IFAT，血清先以1：40稀释，分别滴加在抗原片各孔中，37℃保温，30分钟后，PBS洗三次，吹干，滴加羊抗人荧光抗体IgG，各孔约30μl,37℃保温30分钟,后PBS洗三次,吹干,荧光显微镜观察结果,发现疑似标本后,再以1:16开始作倍比稀释。
结果判定，当待测血清度IgG≥1:64时，仍能观察到清晰菌体，判为阳性并以血清稀释度报告之。
2、PCR检测莱姆病螺旋体DNA。
蜱标本中提取DNA模板：应用美国Genaco公司DNA提取液，将洗净的蜱装入研磨管中研碎，每管加入200-600μlDNA提取液，煮沸约2min至提取液变混浊；冷却后冰浴1min，10000r/min离心1min；将上清移至1.5ml离心管中,加入等量异丙醇,混匀后室温放置15min沉淀DNA,12000r/min离心1min，弃上清.加2倍体积的70%酒精洗涤沉淀，离心后弃上清，自然晾干；加50μlTE溶解DNA，放-20℃冰箱保存，备用。
引物：
名称序列长度（bp）位置（bp）
23S3（上游）5’CGACCTTCTTCGCCTTAAAGC3’213084-3104
23S6（上游）5’TCCTAGGCATTCACCATA3’183105-3122
23S5（下游）5’CTGCGAGTTCGCGGGAGA3’183358-3341
23Sa（下游）5’TAAGCTGACTAATACTAATTACCC3’243495-3472
23S3（上游）/23Sa（下游）为第一轮扩增引物，95℃预变性5min，94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，共35个循环，最后在72℃延伸7min.;23S6（上游）/23S5（下游）为第二轮扩增引物，95℃预变性5min，94℃变性30s，59℃退火30s，72℃延伸30s，共35个循环，最后在72℃延伸7min。取PCR产物5l，用1.5％的琼脂糖胶电泳,溴化乙锭染色，于紫外灯下观察结果。
三、结果：
1、间接免疫荧光检测148例山区农民莱姆病螺旋体，抗体阳性者6例，按性别分组比较，其检莱姆病抗体结果列于表1。
表1不同性别山区农民抗莱姆病IgG检出率
性别被检人数阳性数阳性率
男7833.85%
女7034.29%
X2=0.0795=两者无显著性差异
2、148例山区农民莱姆病相关传播途径及临床症状按性别分组列于表2
表2148例山区农民莱姆病相关传播途径及临床表现
性别蜱叮出现率关节痛出现率
男782025.64%1924.36%
女701927.14%2434.79%
莱姆病抗体阳性与蜱叮X2=0.428P>0.05两者无显著性差异。莱姆病抗体阳性与关节痛X2=1.76P>0.05两者无显著性差异
3、金东区捕到的蜱标本见表3，用半巢式PCR检测，检到微小牛啤一只，长角血啤一只有莱姆病DNA片段。
表3蜱标本半巢式PCR检测结果表
蜱种微小牛蜱长角血蜱合计
数量4150154
阳性112
四、讨论
目前全世界已面临着新发传染病的重大威胁，其中相当一部分属人兽共患媒介生物传染性疾病。莱姆病螺旋体所引起的人类疾病即属这一范畴。
莱姆病螺旋体是通过硬蜱属中的某种蜱叮咬而传染动物和人的，主要见扁板硬蜱、蓖麻硬碑、全沟硬蜱。这次调查时间为9月，仅捕到一只哈氏硬蜱和4只长蝠硬蜱，可能是由于季节不合硬碑属生活
本次调查证实了浙江省有莱姆病螺旋体DNA片。分别从长角血蜱和微小牛蜱。长角血蜱的幼蜱和若蜱，虽可感染莱姆病螺旋体，但不能经期传播到下一发育阶段，不具备经期传播能力，作为莱姆病学主要媒介可能性不大1。但长角血蜱、微小牛蜱可能是过性携带莱姆病螺旋体。浙江省部莱姆部人群血清调查，也证实浙江有莱姆病抗体阳性者，并有病例2本次调查发现莱姆病抗体阳性，其中二份阳性，经中国疾控中心复判确认，可见蜱上的伯氏螺旋体要传染给人，但主要媒介为何蜱种尚需进一步调查。
对蜱类昆虫缺乏认识，对蜱叮史前后皮肤损害不重视，一些患者对严重的关节损害，当成风湿、风湿性关节炎，以致长期治疗无效本次调查的地区均保持较为完好的原始地貌，开发较少，外来人员很少，本地居民偶有类似症状病人。但随着经济发展，这些地区的外来人员增多，完全无免疫力的人员进入，可能会对人群健康产生较为严重危害，应需进一步调查。
（致谢参加本次调查及实验工作的中国军事医学科学院微生物流行病研究所、浙江省金东区的同志。）
参考文献：
1、孙毅、许荣清，张泮河等，长角血蜱嗜群血蜱经期传播莱姆病螺旋体Borleliq、garinii的实验研究,中国人兽共患病杂志200319.37-41
2、张知德、陈永金、梅建华等，浙南地区人群莱姆病血清流行病学研究，中国公共卫生200117（11）1036-1037
作者单位：
1、浙江省疾病预防控制中心
2、金东区疾病预防控制中心
作者简介：姜理平，男，1964年生，1988年毕业于武汉大学病毒系病毒学分子生物学系专业副主任技师从事自然疫源性疾病检验研究
