医学论文,Dot

Dot-ELISA的囊虫病免疫诊断价值

中国人兽共患病杂志1999年第6期第15卷论著

作者：李雅杰　王　敏　王光岳

单位：哈尔滨医科大学寄生虫学教研室（哈尔滨，150086）

　　关键词：Dot-ELISA；囊虫病；囊尾蚴糖蛋白抗原

　　摘要　本文用纯化糖蛋白抗原对116例囊虫病人血清进行Dot-ELISA检测，阳性率为96.8％（112/116）,36例健康人血清皆为阴性，27例肝吸虫病与包虫病人血清除2例外均为阴性，并以IHA和ELISA作对照，结果表明Dot-ELISA在3种方法中敏感性和特异性较高。

APPLICATIONOFDOT-ELISAINIMMUNODIAGNOSISOFCYSTICERCOSIS

LiYajieWangMinWangGuangyue

　　（DepartmentofParasitology,HarbinMedicalUniversity,Harbin150086）

　　ABSTRACT　Dot-ELISAwasusedintheimmunodiagnosisofcysticercosiswiththelentil-lectin.Thepositiveratesoftheserasamplefrom116allshowednegativereactions,and27serafromclonorchiasisandechinocococosisallshowednegativereactionsexcept2sera.TheELISAandIHAweredevaluatedcomparatively.Theresultsindicatedthatthismethodwashighlysensitiveandspecificiindignosis.

　　KEYWORDSDot-ELISACysticercosisGlycoproteinantigen

　　猪带绦虫蚴虫――囊尾蚴寄生于人体导致囊虫病，它严重危害人类身心健康。目前免疫诊断技术已被广泛应用于囊虫病的诊断中，主要有IHA［1］，间接荧光抗体试验（IFA）［2］、ELISA［3］、Dot-ELISA［4］，生物素亲和素系统酶联免疫吸附试验（ABC-ELISA）［5］单克隆抗体酶联免疫吸附试验（McAb-ELISA）［6］，凝胶扩散酶联免疫吸附试验（DIG-ELISA）［7］及酶联免疫转印技术（EITB）［8］等，其中Dot-ELISA又称斑点免疫酶结合试验（DIA）它是在ELISA的基础上以硝酸纤维薄膜（NC膜）代替聚苯乙烯反应板作载体，从而减少了因载体批间差异与抗原吸附性能等因素的影响。我们以植物血凝素和层析技术制备囊尾蚴糖蛋白抗原，进行Dot-ELISA试验，结果表现出高度的灵敏与特异性。

　　1　材料与方法

　　1.1　抗原　采用植物血凝素亲和层析技术制备的囊尾蚴糖蛋白抗原，含量为0.1mg/ml。

　　1.2　血清

　　1.2.1　囊虫病人血清　取自本教研室门诊，根据临床症状，皮下结节活检及头颅CT检查确诊的病人，共116例。

　　1.2.2　正常健康者血清　取自健康献血员，37例。

　　1.2.3　其它寄生虫感染血清　由本教研室提供确诊的肝吸虫病和包虫病患者血清，共27例。

　　1.3　结合物　辣根过氧化物酶标记的羊抗人IgG（HRP-IgG），军科院五所产品，批号：9507，工作浓度：1∶1000。

　　1.4　载体　硝酸纤维素薄膜，为Amersham产品。

　　1.5　底物　4-氯-1-萘酚（SeriR分装）：A液：每60mg溶于20ml甲醇，4℃保存，B液：10mmol/LTris-HCl,pH7.5,150mmol/LNaCl,30%H2O260μl,加去离子水至100ml,4℃保存，用时取A液1ml、B液5ml混匀。

　　1.6　方法　Dot-ELISA　将5μl抗原滴加在0.5cm×1.2cm的NC膜的一端，自然干燥。置于TBS-TM溶液中（5％脱脂奶粉，0.05％Tween-20的TBS溶液，-20℃保存）封闭30min，取出用TBS-T（含0.05％Tween-20的TBS溶液）洗涤3次，每次5min,TBS-TM1∶10稀释等测血清，与NC膜反应1h，每次均设阴性，阳性，TBS对照。取出NC膜，用TBS-T洗涤3次，每次5min。用TBS-TM1∶50倍稀释HRP-IgG，将NC膜与反应1h,以TBS-T洗涤2次，每次5min,TBS（2.42gTris-Base,29.24gNaCl，加去离子水至1000ml，以浓HCl调至pH7.5）洗涤1次，5min后，加底物显色10min，加蒸馏水终止反应，阳性反应为薄膜加抗原处出现蓝色斑点，与白色的硝酸纤维素薄膜背景形成鲜明的对比，阴性反应则整个薄膜为白色或微蓝色。

　　1.7　IHA　具体操作过程参照文献［9］

　　1.8　ELISA　具体操作过程参照文献［10］，最后用酶联免疫检测仪DG-I（南京新华仪器厂产）于波长490nm测OD值，实验所用包被平板的猪囊尾蚴粗抗原的浓度为0.25μg/ml,HRP-IgG稀释度为1∶2000，待测血清的稀释度为1∶40，阳性判定标准：以大于或等于正常人血清的平均OD值+2SD为阳性反应。

　　2　结果

　　2.1　三种方法阳检出率的比较　对116例囊虫病患者血清，36例正常人血清，7例肝吸虫病及包虫病患者血清分别进行Dot-ELISA、IHA、ELISA检测，其结果见表1、2。

表1　囊虫病、正常健康、肝吸虫病及包虫病患者

　　Dot-ELISA、IHA、ELISA三种方法结果比较

表2　Dot-ELISA、IHA、ELISA三种方法的真、假、阴、阳性数

　　经比较，Dot-ELISA、IHA、ELISA的敏感性与特异性分别为96.8和96.8、84.5和88.9、94.8和85.7。

　　3　讨论

　　我们对116例囊虫病患者，36例正常健康者，27例肝吸虫病人与包虫病患者进行dot-ELISA、IHA和ELISA，敏感性分别为96.8％，94.8％，85.5％，经统计学处理，Dot-ELISA和ELISA之间无显著性差异（r=0.418,P＞0.05），Dot-ELISA、ELISA与IHA之间差异显著（r=9.84,P＜0.01,r=6.69,P＜0.01）。特异性分别为96.8％，88.9％，85.7％，经统计学处理，Dot-ELISA、IHA和ELISA间无显著性差异（r=2.99,P＜0.005,r=4.88,P＜0.05）。由此可见，Dot-ELISA、IHA、ELISA三种方法中，Dot-ELISA与ELISA的敏感性较高，明显高于IHA。Dot-ELISA是在ELISA的基础上建立起来的，其载体-NC膜吸附性强，定量加样后不受载体批间差异及抗原吸附地性能的影响。因此，Dot-ELISA不仅保持了ELISA的高敏感性，且检出率高于ELISA。尹舜［10］用囊液粗抗原对108例患者血清进行Dot-ELISA实验，敏感性为93.3％，本实验采用的是经植物血凝素亲和层析技术的囊尾蚴糖抗原，其含量及纯度较高，对116例囊虫病患者的敏感性为96.8％，表明抗原的纯化对提高敏感性有一定的作用。Dot-ELISA与包虫病患者血清仍有一定的交叉反应，这是由于包虫与囊尾蚴有部分相同抗原成分。由于Dot-ELISA阳性的色斑与白色的NC膜能形成鲜明对比，不需任何仪器，肉眼即可判定结果，且结果可以长期保存，有利于复查和对照；而滴有抗原的NC膜经自然干燥后，置玻璃瓶于4℃下，又可保持2个月活性不变，已被多批试验所证实［11］。最后，用Dot-ELISA检测，用时较短，适于基层及流行病学调查。

　　4　参考文献

　　1.连建安，等.斑点ELISA和间接血凝诊断囊虫病比较.中国寄生虫学与寄生虫病杂志，1991,9（2）:109.

　　2.温培娥，等.间接荧光抗体试验诊断囊虫病的观察.中国寄生虫病防治杂志，1990,8（1）:33.

　　3.时法茂，等.脑囊虫病免疫诊断方法的比较.中国寄生虫学与寄生虫病杂志，1991,9（4）:320.

　　4.姜洪杰，等.Dot-ELISA在脑囊虫病诊断中的应用.中国寄生虫学与寄生虫病杂志，1990,8（3）:207.

　　5.赵瑞，等.生物素亲合素系统ELISA诊断囊虫病.中国寄生虫病防治杂志，1990,3（2）:130.

　　6.张洪花，等.McAb检测囊尾蚴循环抗原诊断脑囊虫病试剂盒的研制.中国寄生虫病防治杂志，1992,5（3）:178.

　　7.石裕明，等.SDS-Dot-ELISA在华支睾吸虫病诊断中的应用.中国寄生虫病防治杂志，1996,9（2）:114.

　　8.李素云，等.酶联免疫印渍法检测脑囊虫病人循环抗原的研究.中国寄生虫病防治杂志，1996,9（2）;114.

　　9.许蔓芳，等.应用酶联免疫吸附试验检测病人血清中抗囊虫抗体.哈尔滨医科大学学报，1980,14（3）:5.