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实验性蛛网膜下腔出血对脑微血管内皮细胞的作用研究

时间 : 2009-12-01 12:51:58 来源:www.clotlw.cn

[摘要]

实验性蛛网膜下腔出血对脑微血管内皮细胞的作用研究,摘要: 目的 建立实验性蛛网膜下腔出血后内皮细胞损伤模型,并观察血性脑脊液(bloody cerebralspi-nal fluid,BCSF)对培养的微血管内皮细胞的损害作用。 方法 将

  摘要:目的建立实验性蛛网膜下腔出血后内皮细胞损伤模型,并观察血性脑脊液(bloodycerebralspi-nalfluid,BCSF)对培养的微血管内皮细胞的损害作用。方法将体外培养的兔脑微血管内皮细胞分为对照组和BCSF刺激组,通过MTT比色法选择恰当孵育时间的BCSF作为刺激因素,观察病理形态学改变、细胞计数、流式细胞术细胞周期,分析评估内皮细胞损害和增殖状况。结果与对照组比较,孵育7天BCSF可使内皮细胞出现明显的病理形态学改变,贴壁细胞数量减少,MTT吸光度下降(P<0.01),G0~G1期细胞比例增高(P<0.01)。结论BCSF可直接造成明显的兔脑微血管内皮细胞病理形态学损害,并抑制血管内皮细胞代谢和增殖。  关键词:脑血管痉挛;蛛网膜下腔出血;内皮细胞;兔  Effectofexperimentalsubarachnoidhemorrhageonmicrovesselendothelialcellsofbrain  CHENZhi,WUNan,LIFei,etal.  (DepartmentsofNeurosurgery,SouthwestHospital,ThirdMilitaryMedicalUniversity,Chongqing400038,China)织梦好,好织梦  Abstract:ObjectiveToestablishanendothelialcellmodelinvitrofollowingexperimentalsubarachnoidhemor-rhage,andstudythecytoxiceffectofbloodycerebrospinalfluid(BCSF)onendothelialcells.MethodsRabbitbrainmi-crovesselendothelialcells(BmvECs)weredividedintoacontrolgroupandaBCSFgroup.MTTassaywastakentoevalu-atetheinjuryofBCSFincubatedfordifferenttimeonBmvECsinordertodecidethesuitableBCSFaspathogen.Morpho-logicalchanges,cellcounting,MTTassay,flowcytometricanalysiswereusedtoevaluatethecytoxiceffectsonBmvECs.ResultsBCSFcouldcauseseveremorphologicchangesinBmvECsanddecreasedMTTassay,andincreasedcellpropor-tionofG0-G1ofBmvECs(P<0.01).ConclusionBCSFcouldcausedirectinjuryonendothelialcells,includingmor-phologicalchangesanddecreasedproliferation.  Keywords:cerebralvasospasm;subarachnoidhemorrhage;endothelialcells;rabbits织梦内容管理系统  出血性脑血管疾病继发或颅脑创伤后蛛网膜下腔出血(SAH)诱发的慢性脑血管痉挛(chroniccerebralvasospasm,CVS)是SAH致死或致残的主要原因,严重影响原发疾病的预后。CVS发生的病因和机制研究已持续了数十年,至今尚未完全阐明。大量研究已证实血管内皮细胞的损害在CVS发生发展中起到十分重要的作用,因此,血管内皮细胞的损害机制及保护是CVS防治研究的关键环节之一。本研究采用体外孵育的兔血性脑脊液(bloodycerebralspinalfluid,BCSF)模拟SAH刺激因素作用培养的兔脑微血管内皮细胞(brainmicrovesselendothelialcells,BmvECs),观察BCSF对内皮细胞病理形态学、增殖改变的影响,为建立CVS内皮细胞损伤模型及后续研究提供依据。  材料与方法  1兔脑微血管内皮细胞的分离、培养及鉴定  8~12周大小的NewZealand白兔麻醉后颈动脉放血法处死,断头颅去皮后浸入75%的乙醇中消毒约1分钟,无菌状态下取出兔脑,分离出大脑皮质,按匀浆后筛网过滤法分离培养兔脑微血管内皮细胞;Ⅷ因子相关抗原免疫组化染色鉴定脑微血管内皮细胞。内容来自dedecms  2人工血性脑脊液的制备[1]  无菌条件下取正常人血液与配制人工脑脊液,并按1:1比例混合;将其置于37℃水浴温箱中孵育7天后将样品取出离心(10100g,20分钟),留取上清液4℃贮存备用;使用前,将上述离心上清液与DMEM培养基按2:1的比例配制,即得到本研究中采用的血性脑脊液。  3不同孵育时间BCSF对内皮细胞活力的影响  将传代细胞分别接种于培养板或培养瓶培养至近汇合为单层,更换无血清培养基培养24小时,将细胞随机分为正常对照组(Control)、不同孵育天数的BCSF刺激组(BCSF1、BCSF3、BCSF5、BCSF7、BCSF9、BCSF12)。正常对照组加入无血清培养液,BCSF刺激组分别加入BCSF1、BCSF3、BCSF5、BCSF7、BCSF9、BCSF12。按上述分组以每孔1×104个细胞接种于96孔板中,37℃、5%CO2孵箱内静置培养,24小时后按分组处理;24小时后取出96孔板,每孔加入MTT溶液(5mg.ml)20μl后,继续37℃、5%CO2孵箱内静置培养4小时后终止培养,吸弃孔内培养上清液,每孔加入150μl二甲亚砜,振荡10分钟;选择490nm波长,在酶联免疫检测仪上测定各孔光吸收值。copyrightdedecms  4实验细胞分组  将传代细胞分别接种于培养板或培养瓶培养至近汇合为单层,更换无血清培养基培养24小时。根据上步的实验结果选择适当孵育天数的BCSF作为刺激因素,将细胞随机分为正常对照组(Control)、BCSF刺激组(BCSF)。织梦好,好织梦

  5形态学观察

  倒置显微镜形态观察各组实验细胞的生长状况及细胞形态,连续3天;实验细胞分组处理24小时后,用细胞刮将其刮下离心,3%戊二醛固定,1%四氧化锇后固定,常规包埋、切片、电子染色后2000EX透射电镜观察。

  6内皮细胞增殖测定

  (1)细胞计数:按上述分组将传代细胞接种于24孔培养板,处理结束后消化收集细胞,血球计数板计数。(2)流式细胞术细胞周期分析:按文献报道方法将各组细胞制成悬液后,加入PI至终浓度为50μg.ml进行荧光染色(避光,冰浴30分钟),4小时内上机检测细胞各周期的细胞数及占总细胞数的百分比。每个样品检测10000个细胞,计算G0.G1期、S期、G2.M期的细胞数及比例。
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