应用ＰＣＲ－ＳＳＣＰ检测先天性软骨发育不全患者 ,论文发表，论文代写

　　【摘要】目的应用PCR-Single-Strondedconformationpolymorphism（PCR-SSCP）技术对先天性软骨发育不全患者进行检测。方法对3例疑似先天性软骨发育不全患者、1例确诊患者应用基因组DNA聚合酶链反应-单链构象多态技术进行检测。结果3例疑似患者中2例出现和确诊患者同样的异常泳带，此泳带在正常人中不存在。结论PCR-SSCP技术可实现对先天性软骨发育不全患者的检测。　　【关键词】先天性软骨发育不全；聚合酶链反应；单链构象多态　　　　DetectionofachondroplasiabyPCR-SSCP　　ZHAOXin,WUYu,ZHUXiao-he.　　　　【Abstract】ObjectiveTodetectionachondroplasiabyPCR-SSCP.MethodsThegenomicDNAfrom1clinicallydiagnosedachondroplasiapatientand3suspiciouspatientswithachondroplasiawasdiagnosedbypolymerasechainreaction-restrictionfragmentlengthpolymorphism（PCR-SSCP）.Results2in3suspiciouspatientswithachondroplasiahavethesameabnormalband,whichdoesnotexistinnormalpeople.ConclusionPCR-SSCPcanbeusedthediagnosisofachondroplasia.　　【Keywords】Achondroplasia;Polymerasechainreaction;Single-Strondedconformationpolymorphism　　　　先天性软骨发育不全（achondroplasia，ACH）是小儿遗传性侏儒症中最常见的类型，在活产婴儿中的发病率为1/15000～1/77000，为常染色体显性遗传，无家族史，约80%患者为散发型。表现为短肢型身材矮小，头大，前额和顶骨圆凸，鼻梁下陷，腰椎前凸，弓形腿，“V”字形手等。至今已发现ACH的3种基因突变，均位于FGFR3跨膜区，多数为1138位核苷酸的G→A转换，少数为G→C颠换，还有个别为1123位核苷酸的G→T颠换。　　　　1对象与方法　　　　1．1对象沈阳市中国医科大学第二附属医院儿科遗传门诊的3例疑似ACH患者、1例确诊患者和1名无ACH家族史的正常人。　　1．2方法　　1．2．1DNA模板的制备取受试者静脉血5ml，加EDTA抗凝剂0．5ml混匀，用常规方法，血标本经蛋白酶K处理，苯酚/氯仿抽提，无水乙醇沉淀，沉淀物溶于缓冲液（10mmol/LTris-HCl，pH7．4；1mmol/LEDTA，pH8．0）。所得DNA用紫外分光光度计检测吸光度，A260/A280约为1．8。　　1．2．2基因片段PCR扩增引物合成：上游引物和下游参照文献，由上海博亚公司合成，引物序列为：5′-AGGAGCTGGTGGAGGCTGA-3′和5′-GGAGATCTTGTGCACGGTGG-3′PCR反应体系：每25μl反应体系中，含10×PCR缓冲液2．5μl，dNTP2μl，上游和下游引物各2．5μl，TaqDNA聚合酶0．2μl，去离子水10．3μl，模板DNA5μl。　　反应程序：94℃变性8min后，按94℃40s、65℃30s、72℃40s循环30次，最后72℃延伸7min结束反应。　　1．2．3PCR扩增产物鉴定取PCR扩增产物10μl，指示剂溴酚蓝1μl混匀后加入2%琼脂糖凝胶孔中，电泳缓冲液1×TDE，80V电泳30min，溴化乙锭染色后紫外灯下观察。检查有无扩增出目的条带及扩增出的目的条带是否理想，如不理想或有非特异性条带存在，则重新扩增直至得到较理想的扩增产物。　　1．2．4单链构象多态性分析取PCR产物5μl，加入等体积的变性液（95%甲酰胺，20mmol/LEDTA，0．05%二甲苯蓝，0．05%溴酚蓝）混匀，97℃变性10min，使PCR产物解为单链，立即将解链产物置冰浴中骤冷5min。将此变性产物加入12%非变性聚丙烯酰胺凝胶（49∶1）中，室温100V恒压垂直电泳200min。待溴酚蓝走至胶底，二甲苯蓝走至约2/3胶长时，停止电泳。溴化乙锭染色，紫外灯下检测电泳条带并照相。　　　　2结果　　　　2．1PCR扩增产物鉴定结果PCR产物经琼脂糖凝胶电泳后，观察证实每一标本都扩增出来。　　2．2单链构象多态性分析结果样品DNA经SSCP分析，3例疑似ACH患者中发现P1、P2存在和阳性对照相同的单链泳动变位，带形一致，说明存在相同的DNA碱基变异。另外1例疑似患者P3以及正常对照未发现单链泳动变位。见图1。　　　　　　3讨论　　　　先天性软骨发育不全（ACH）是小儿遗传性侏儒症中最常见的类型，是一种由于软骨内化骨缺陷导致的发育异常，又称胎儿型软骨营养障碍、软骨营养障碍性侏儒等。ACH是完全外显的常染色体显性遗传，无家族史，约80%患者为散发型，为新生突变，与父亲年龄较大有关。近十年来，对此症的基因诊断有了突破性的进展。Shiang等和Rousseau等发现成纤维细胞生长因子受体3（FGFR3）跨膜区基因第10外显子1138位核苷酸的点突变是ACH发病的原因，其中95%以上为G→A转换，尚有少数发生G→C的颠换，该突变使得第380位密码子由编码甘氨酸转变为精氨酸，导致跨膜　　区结构发生变化，从而引起成纤维细胞生长因子受体3蛋白异常，最终导致先天性软骨发育不全。1994年，Francomano等通过连锁分析，将ACH的致病基因定位于4p16．3，研究发现FGFR3也恰在此范围内。FGFR3是一种酪氨酸激酶受体，含有806个氨基酸残基，FGFR3基因长约15Kb，由19个外显子和18个内含子组成，其中第10外显子编码FGFR3跨膜区。　　国外学者Superti-Furga等和Ivegawa等还发现极少数患者不是FGFR3跨膜区380位的突变，而是FGFR3跨膜区375位的突变，即由半胱氨酸替代了甘氨酸。然而这种突变也局限在FGFR3的跨膜区，进一步说明FGFR3跨膜区与软骨发育不全的发病机制有关。　　目前用于检测基因点突变的方法有很多，其中Orita等建立的SSCP技术具有简便、快速和适于大样本筛查等优点，可用于检测单个碱基置换、数个碱基插入或缺失等基因变异。经与PCR技术结合，在突变分析中发挥着重要的作用。PCR-SSCP的原理是PCR产物变性后可产生两条互补的单链，各单链根据自己的一级结构而形成不同的构象。单链DNA的构象主要取决于其碱基序列，长度相同，但碱基序列不同甚至单个核苷酸发生突变，其单链的构象也随之变化，并导致电泳迁移率的差异，在电泳凝胶上显现出不同带形。影响PCR-SSCP方法检出突变的因素较多，如扩增片段的长度、突变性质、电泳支持介质及工作条件等等。用于SSCP分析的核酸片段越小，检测的敏感性越高[8]，根据资料显示，对于200bp的片段，检出率>90%[9]，本文的扩增片段长度为164bp，故可期望获得较高的检出率。PCR-SSCP分析方法检测基因突变的优点在于操作简便、快速、经济、易于掌握，已被广泛用于筛查已知突变位点，识别未知突变，以及多态性的分析。　　|||　　【摘要】目的应用PCR-Single-Strondedconformationpolymorphism（PCR-SSCP）技术对先天性软骨发育不全患者进行检测。方法对3例疑似先天性软骨发育不全患者、1例确诊患者应用基因组DNA聚合酶链反应-单链构象多态技术进行检测。结果3例疑似患者中2例出现和确诊患者同样的异常泳带，此泳带在正常人中不存在。结论PCR-SSCP技术可实现对先天性软骨发育不全患者的检测。　　【关键词】先天性软骨发育不全；聚合酶链反应；单链构象多态　　　　DetectionofachondroplasiabyPCR-SSCP　　ZHAOXin,WUYu,ZHUXiao-he.　　　　【Abstract】ObjectiveTodetectionachondroplasiabyPCR-SSCP.MethodsThegenomicDNAfrom1clinicallydiagnosedachondroplasiapatientand3suspiciouspatientswithachondroplasiawasdiagnosedbypolymerasechainreaction-restrictionfragmentlengthpolymorphism（PCR-SSCP）.Results2in3suspiciouspatientswithachondroplasiahavethesameabnormalband,whichdoesnotexistinnormalpeople.ConclusionPCR-SSCPcanbeusedthediagnosisofachondroplasia.　　【Keywords】Achondroplasia;Polymerasechainreaction;Single-Strondedconformationpolymorphism　　　　先天性软骨发育不全（achondroplasia，ACH）是小儿遗传性侏儒症中最常见的类型，在活产婴儿中的发病率为1/15000～1/77000，为常染色体显性遗传，无家族史，约80%患者为散发型。表现为短肢型身材矮小，头大，前额和顶骨圆凸，鼻梁下陷，腰椎前凸，弓形腿，“V”字形手等。至今已发现ACH的3种基因突变，均位于FGFR3跨膜区，多数为1138位核苷酸的G→A转换，少数为G→C颠换，还有个别为1123位核苷酸的G→T颠换。　　　　1对象与方法　　　　1．1对象沈阳市中国医科大学第二附属医院儿科遗传门诊的3例疑似ACH患者、1例确诊患者和1名无ACH家族史的正常人。　　1．2方法　　1．2．1DNA模板的制备取受试者静脉血5ml，加EDTA抗凝剂0．5ml混匀，用常规方法，血标本经蛋白酶K处理，苯酚/氯仿抽提，无水乙醇沉淀，沉淀物溶于缓冲液（10mmol/LTris-HCl，pH7．4；1mmol/LEDTA，pH8．0）。所得DNA用紫外分光光度计检测吸光度，A260/A280约为1．8。　　1．2．2基因片段PCR扩增引物合成：上游引物和下游参照文献，由上海博亚公司合成，引物序列为：5′-AGGAGCTGGTGGAGGCTGA-3′和5′-GGAGATCTTGTGCACGGTGG-3′PCR反应体系：每25μl反应体系中，含10×PCR缓冲液2．5μl，dNTP2μl，上游和下游引物各2．5μl，TaqDNA聚合酶0．2μl，去离子水10．3μl，模板DNA5μl。　　反应程序：94℃变性8min后，按94℃40s、65℃30s、72℃40s循环30次，最后72℃延伸7min结束反应。　　1．2．3PCR扩增产物鉴定取PCR扩增产物10μl，指示剂溴酚蓝1μl混匀后加入2%琼脂糖凝胶孔中，电泳缓冲液1×TDE，80V电泳30min，溴化乙锭染色后紫外灯下观察。检查有无扩增出目的条带及扩增出的目的条带是否理想，如不理想或有非特异性条带存在，则重新扩增直至得到较理想的扩增产物。　　1．2．4单链构象多态性分析取PCR产物5μl，加入等体积的变性液（95%甲酰胺，20mmol/LEDTA，0．05%二甲苯蓝，0．05%溴酚蓝）混匀，97℃变性10min，使PCR产物解为单链，立即将解链产物置冰浴中骤冷5min。将此变性产物加入12%非变性聚丙烯酰胺凝胶（49∶1）中，室温100V恒压垂直电泳200min。待溴酚蓝走至胶底，二甲苯蓝走至约2/3胶长时，停止电泳。溴化乙锭染色，紫外灯下检测电泳条带并照相。　　　　2结果　　　　2．1PCR扩增产物鉴定结果PCR产物经琼脂糖凝胶电泳后，观察证实每一标本都扩增出来。　　2．2单链构象多态性分析结果样品DNA经SSCP分析，3例疑似ACH患者中发现P1、P2存在和阳性对照相同的单链泳动变位，带形一致，说明存在相同的DNA碱基变异。另外1例疑似患者P3以及正常对照未发现单链泳动变位。见图1。　　　　　　3讨论　　　　先天性软骨发育不全（ACH）是小儿遗传性侏儒症中最常见的类型，是一种由于软骨内化骨缺陷导致的发育异常，又称胎儿型软骨营养障碍、软骨营养障碍性侏儒等。ACH是完全外显的常染色体显性遗传，无家族史，约80%患者为散发型，为新生突变，与父亲年龄较大有关。近十年来，对此症的基因诊断有了突破性的进展。Shiang等和Rousseau等发现成纤维细胞生长因子受体3（FGFR3）跨膜区基因第10外显子1138位核苷酸的点突变是ACH发病的原因，其中95%以上为G→A转换，尚有少数发生G→C的颠换，该突变使得第380位密码子由编码甘氨酸转变为精氨酸，导致跨膜　　区结构发生变化，从而引起成纤维细胞生长因子受体3蛋白异常，最终导致先天性软骨发育不全。1994年，Francomano等通过连锁分析，将ACH的致病基因定位于4p16．3，研究发现FGFR3也恰在此范围内。FGFR3是一种酪氨酸激酶受体，含有806个氨基酸残基，FGFR3基因长约15Kb，由19个外显子和18个内含子组成，其中第10外显子编码FGFR3跨膜区。　　国外学者Superti-Furga等和Ivegawa等还发现极少数患者不是FGFR3跨膜区380位的突变，而是FGFR3跨膜区375位的突变，即由半胱氨酸替代了甘氨酸。然而这种突变也局限在FGFR3的跨膜区，进一步说明FGFR3跨膜区与软骨发育不全的发病机制有关。　　目前用于检测基因点突变的方法有很多，其中Orita等建立的SSCP技术具有简便、快速和适于大样本筛查等优点，可用于检测单个碱基置换、数个碱基插入或缺失等基因变异。经与PCR技术结合，在突变分析中发挥着重要的作用。PCR-SSCP的原理是PCR产物变性后可产生两条互补的单链，各单链根据自己的一级结构而形成不同的构象。单链DNA的构象主要取决于其碱基序列，长度相同，但碱基序列不同甚至单个核苷酸发生突变，其单链的构象也随之变化，并导致电泳迁移率的差异，在电泳凝胶上显现出不同带形。影响PCR-SSCP方法检出突变的因素较多，如扩增片段的长度、突变性质、电泳支持介质及工作条件等等。用于SSCP分析的核酸片段越小，检测的敏感性越高[8]，根据资料显示，对于200bp的片段，检出率>90%[9]，本文的扩增片段长度为164bp，故可期望获得较高的检出率。PCR-SSCP分析方法检测基因突变的优点在于操作简便、快速、经济、易于掌握，已被广泛用于筛查已知突变位点，识别未知突变，以及多态性的分析。　　|||　　同时SSCP作为筛查某一区域DNA点突变的灵敏的分子生物学检测技术，其检测条件可因DNA片段长度及核苷酸组成有很大差别，电泳条件可因突变类型不同而各异，故较难掌握；其二，可因加量不适当导致多态性条带，与正常条带重叠不易判断；另外还可由于变性不彻底而出现双链，特别是异源双链的干扰而影响实验结果的准确性。　　　　参考文献　　1ShiangR,ThompsonLM,ZhuYZ,etal.MutationsinthetransmembranedomainofFGFR3causethemostcommongeneticformofdwarfism.Achondroplasia.Cell,1994,78（2）:335-342.　　2RousseauF,BonaventureJ,Legeai-MalletL,etal.Mutationsinthegeneencodingfibroblastgrowthfactorreceptor-3inachondroplasia.Nature,1994,371:252-254.　　3FrancomanoCA,OrtizdeLunaRI,HefferonTW,etal.Localizationoftheachondroplasiagenetothedistal2．5Mbofhumanchromosome4p.HumMolGenet,2004,3（5）:787-792.　　4Perez-CastroAV,WilsonJ,AltherrMR.Genomicorganizationofthemousefibroblastgrowthfactorreceptor-3（FGFR3）gene.Genomics,1995,30（2）:157-162.　　5Superti-FurgaA,EichG,BucherHU,etal.Aglycine375-to-cysteinesubstitutioninthetransmembranedomainofthefibroblastgrowthfactorreceptor-3inanewbornwithachondroplasia.EurJPediatr,1995,154:215-219.　　6IkegawaS,FukushimaY,IsomuraM,etal.Mutationsofthefibroblastgrowthfactorreceptor-3geneinonefamilialandsixsporadiccasesofachondroplasiainJapanesepatiants.HumGenet,1995,96:309-311.　　7OritaM,IwhanaH,KanazawaH,etal.DetectionofpolymorphismsofhumanDNAbygelelectrophoresisassinglestrandconformationpolymorphisms.ProceedingsoftheNationalAcademyofSciences,1999,86:2766-2770.　　8SheffieldVC,BeckJS,KwitekAE,etal.Thesensitivityofsingle-strandconformationpolymorphismanalysisforthedetectionofsinglebasesubstitutions.Genomics,1993,16:325-332.　　9GaidanoG,BalleriniP,GongJZ,etal.p53mutationsinhumanlymphoidmalignancies:associationwithBurkittlymphomaandchroniclymphocyticleukemia.ProceedingsoftheNationalAcademyofSciences,1991,88:5413.　　|||||||||||||||||||||||||||||||||应用ＰＣＲ－ＳＳＣＰ检测先天性软骨发育不全患者王丹鹤　赵　心　吴　俣　朱霄鹤&nb