应用ARMS法检测16例云南省少数民族葡萄糖

时间 : 2009-11-30 14:39:31 来源：med.qe.cn

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[摘要]

葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（G6PD）缺乏症呈全球性多民族分布。我国主要分布在长江以南地区，不同地区的不同民族发病率不同。目前全球已鉴定的G6PD基因突变型有122种以上［1］，各种基因突变型分布有地区和民族异质性。我国已鉴定的基因突变型有14种，均为单个碱基置换的点突变［2］。云南省是多民族省份，又属G6PD缺乏症高发区，由于各少数民族地区经济文化差异和人口流动性较小，形成相对封闭和独立的居住群体，为了解这些民族G6PD缺乏症患者的基因突变型的情况，我们筛选出我省16例纯种少数民族患者，采用突变特异性扩增系统（ARMS）法，检测中国人群中最常见的三种突变型，即G1376T、G1388A和A95G。对所检出的突变做DNA测序证实。现将结果报道如下。

　　病例和方法

　　1　病例选择和标本制备　16例G6PD缺乏症患者均为云南各少数民族地区的纯种少数民族居民，无外族通婚史。经NBT纸片法筛查后，NADP-紫外分光还原法测定酶活性，证实为G6PD缺乏症。所有病例均取静脉血5ml，常规蛋白酶K消化，酚-氯仿-异戊醇抽提法提取DNA，乙醇沉淀，TE溶解。

　　2　聚合酶链反应（PCR）

　　2.1　ARMS法引物由中山医科大学医学遗传学研究室提供。三种突变引物均设计成下游引物，内对照引物（4FR）为抗肌营养不良蛋白基因第4外显子的一对正常引物。所有引物系列和扩增片段长度见表1。

表1　鉴定中国人常见的三种点突变的ARMS引物

引物序列扩增片段长度检测点突变退火温度1388L5′-GACCTGACCTACGGCAACAGATA-3′361bpG1388A62℃1388M5′-GGTGCAGCAGTGGGGTGAAATTAT-3′1376L5′-GACCTGACCTACGGCAACAGATA-3′345bpG1376T62℃1376M5′-TGAAAATACGCCAGGCCTCAA-3′95L5′-GTGTCACCCTGGTGTGAGACCC-3′226bpA95G60℃95M5′-CACCCATGATGATGAATTTGC-3′内对照4F5′-TTGTCGGTCTCCTGCTGGTCAGTG-3′196bp4R5′-CAAAGCCCTCACTCAAACATGAAGC-3′

　　2.2　反应体系：PCR在英国HYBAID公司Omm-E型热循环仪上进行。反应体积20μl，含基因组DNA约0.4μg,dNTP（2mmol/L）2.0μl,上游引物和下游引物各10pmol，内对照引物15pmol,Taq酶1.5μl（加拿大Genda公司）,覆盖石蜡油15μl。94℃变性5min后进入热循环，循环条件为94℃变性30s，62℃或60℃（各引物退火温度见表1）45s，72℃延伸50s，共25个循环后于72℃保温5min。

　　2.3　结果观察：取PCR产物6μl与1μl上样缓冲液混合，于80g/L的聚丙烯酰胺凝胶中电泳，电泳缓冲液为0.5×TBE,恒压100V,电泳1.5h后揭胶。将凝胶置体积分数为10%的乙醇固定5min，10g/L硝酸离子化3min，0.02mol/L硝酸银于摇床上染色20min,0.28mol/L碳酸钠加体积分数为0.019%的甲醛显色至带型清楚,体积分数为10%的醋酸再固定2min,每步之间均用蒸馏水冲洗,最后干胶保存。

　　2.4　测序:对ARMS法检测到的阳性样品随机抽取4份，选用突变所在外显子的正常引物进行PCR,扩增体积180μl,10g/L低熔点琼脂糖凝胶电泳回收扩增产物，经醋酸胺和异丙醇纯化后，以ABIMode337型DNA自动测序仪进行测序。

　　1　图1显示G1388A突变出现一条361bp特异扩增带和一条196bp的内对照扩增带，正常标本仅有196bp的内对照带。图2显示检出的1例G1376T突变的一条345bp特异性扩增带和一条196bp内对照扩增带。所检病例中未发现A95G突变。

1：DNAMark;2：正常DNA；3，6，9：G1388A突变的阳性对照；

　　4，5，7，8，10，11：所检出的G1388A突变病例。

　　所有样品都有196bp内对照带，361bp为G1388A突变的特异扩增带

图1　G1388A突变的ARMS检测结果

1：DNAMark;2，5：正常DNA；3：G1376T突变的阳性对照；　　4，6：所检样品的非G1376T突变病例；7：所检出的G1376T突变病例。　　所有样品都有196bp内对照带；345bp为G1376T突变的特异扩增带图2　G1376T突变的ARMS检测结果　　2　我们分别随机抽取4例和1例由ARMS法检出的G1388A突变及G1376T突变病例,对其突变所在的外显子进行测序，结果与ARMS检测的结果完全一致。还发现1例G1388A突变同时伴有第11内含子C93T。　　讨论　　ARMS是一种检测已知点突变的方法，其原理是：在PCR中，如果引物3′端不能与模板的碱基配对，用耐热的DNA聚合酶是无法延伸的，因而可针对某个点突变设计出3′端碱基与目的基因的突变碱基相互补的引物，称ARMS引物，用它去扩增待测的DNA样品时，只有突变的基因才有相应的扩增产物，而正常的基因不能完成扩增,根据有无扩增产物即可判断为何种突变［3］。在实际应用中由于3′端单个碱基的错配在扩增时并非绝对不能延伸，所以在离引物3′端2～3个碱基处再设置一个错配碱基，以增加特异性。由于PCR是否有扩增产物受反应体系中各种因素和条件的影响，因此选用dystrophin基因第4外显子的一对引物作为内对照引物，与ARMS引物一起进行双重PCR扩增，该内对照引物扩增效果非常稳定，可起到很好的对照作用，同时内对照扩增带还可反映模板DNA的质和量。　　我们随机抽取4份用ARMS法检测到的两种突变DNA样品进行直接测序分析，结果与ARMS的结果一致,说明ARMS法应用于G6PD基因G1388A和G1376T两个点突变的检测是可行的，而且有很高的准确率。与单链构象多态性分析（SSCP）、ASO探针斑点杂交以及设置酶切位点进行扩增（ACRS）等方法比较,ARMS法操作简单、不需放射性核素、不需限制性内切酶，只需一个PCR体系，用琼脂糖凝胶电泳，EB染色，也可判断结果。因此，用ARMS法检测G6PD基因突变具有快速、准确、省钱省力的特点,尤其适合大批量样品的检测。云南属我国少数民族聚居的地区,共有26个少数民族,各民族已鉴定的G6PD基因突变型除我们报道的结果外,已报道的还有:傣族G1376T、G392T［4］,彝族G1376T、A95G，纳西族G1388A［5］。　　位于12外显子上1388和1376位点，以及第2外显子上95位点的突变是中国人及海外华侨G6PD缺陷最常见和最具特征性的三种点突变。而我省上述各民族中也发现G1388A和G1376T突变，而且有较高的突变率,提示我国各民族具有共同的起源。我们在测序时发现1例G1388A伴有第11内含子C93T,其中C93T的发生频率尚未确定，任晓琴等［6］认为其可能是一个多态性位点。由于G6PD基因突变型分布有地区和民族异质性，我省各少数民族地区由于地理环境和经济文化条件的制约，各民族呈相对隔离的居住群体。这些少数民族的基因型鉴定对指导优生优育、提高我省民族人口素质具有重要作用，为研究我国各民族的起源、变迁提供人类学资料，也是“人类基因组多样性计划”的一个组成部分。　　基金项目：云南省应用基础研究基金资助项目［97（055M）］；云南省教委科研基金资助项目（9612103）参考文献　　1，VulliamyT,LluzzattoL,HironoA,etal.Hematologicallyimportantmutations:glucose-6-phosphatedehydrogenase.BloodCellMolDis,1997,23:302-313.　　2，杜传书，何永蜀.云南汉族中所见一例G6PD基因nt1004C→A突变.中华血液学杂志，1997，18：535-537.　　3，NewtonCR,GrahamA,HeptinstallLE,etal.AnalysisofanypointmutationinDNA.Theamplificationrefractorymutatinsystem（ARMS）.NuclAcidRes,1989,17:2503-2516.　　4，蒋玮莹.云南傣族中所见的G6PD突变型.遗传，1997，19：33-35.　　5，何永蜀,杜传书，蒋玮莹，等.云南省几个民族葡萄糖-6-磷酸脱氢酶基因突变型分析.中华血液学杂志,1997,18:193-196.　　6，任晓琴，杜传书，林群娣，等．葡萄糖-6-磷酸脱氢酶cDNAC1311T的多态性.中华血液学杂志,1999,20:197-199.（收稿日期：1999-10-27）

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