骨髓基质干细胞移植治疗兔股骨头缺血性坏死的实验研究

【摘要】［目的］探讨骨髓基质干细胞移植对股骨头缺血性坏死的治疗作用和修复机理，为临床应用提供依据。［方法］24只新西兰大白兔随机分为两组，A组为髓芯减压组，B组为干细胞移植组。采用液氮冷冻法造模。A组钻孔后植入空白明胶海绵，B组钻孔后植入复合有骨髓基质干细胞的明胶海绵。术后每组分别于2、4、6、8周各处死3只动物，做X线及组织学检查。［结果］（1）X线结果：2周时A、B组钻孔区均呈低密度，4周时A组钻孔边缘密度增加，B组整个钻孔区密度增加，8周时A组钻孔区均呈低密度，边缘形成硬化线，B组钻孔区形成骨小梁结构。（2）组织学结果：2周时A组钻孔区出现少许炎症细胞，边缘出现较多成骨细胞并有骨组织形成，至8周时，钻孔区内形成骨髓组织，只在边缘形成骨小梁结构。2周时B组钻孔区有大量的成骨细胞，边缘有较多骨组织形成，4周时钻孔区内充满新生骨小梁结构，8周时钻孔区内骨小梁成熟，小梁有骨髓组织填充。［结论］骨髓基质干细胞对兔股骨头缺血性坏死有良好的修复作用。

【关键词】股骨头缺血性坏死；动物模型；骨髓基质干细胞；细胞培养；移植

　　Experimentalstudyontreatmentoffemoralheadnecrosisinrabbitwithtransplantationofbonemarrowstromalcells∥　　Abstract：［Objective］Toinvestigatetherepairingeffectandmechanismfortreatmentoffemoralheadnecrosisontransplantationofbonemarrowstromalcells.［Method］Twenty-fourNewzlandrabbitsweredividedintotwogroupsrandomly,GroupAascoredecompressiongroupandGroupBasBonemarrowstromalcellsautograftgroup.Animalfemoralheadneorosismodelwasmadebyfreezingmethodwithliquidnitrogen.Afterfreezinganddrilling,ThedrillednecroticcavitiesofGroupAwasimplantedwithgelatinsponge,whileofGroupBwaswithgelatinspongecombinedbybonemarrowstromalcells.Threeanimalsineverygroupweresacrificedrespectivelyat2,4,6,8weeksandsubjectedtoradiographandmicroscopeexamination.［Result］（1）Radiographexamination:At2weeks,thedrilledholesinGroupAandBallpresentedlowdensityimages.At4weeks,thedensityinthedrilledholesincreasedingroupBandthedensityaroundthedrilledholesincreasedingroupA.At8weeks,scleroticlineformedaroundthedrilledholesinGroupAandtrabeculaeappearedinthedrilledholesingroupB.（2）Microscopeexamination:ingroupA,at2weeks,afewinflamatorycellsappearedintheholeswithmanyosteoblastsandostoidappearedaroundthedrilledholes.At8weeks,marrowformedinthedrilledholesingroupB,at2weeks,therewerealargeamountofosteoblastsinthedrilledholesandsomeostoidformedaroundthcdrilledholes.At4weeks,thedrilledholeswerefulloftrabeculae.At8weeks,thetrabeculaematuredwiththemarrowappearedintheintertrabecularspace.［Conclusion］Bonemarrowstromalcellsautograftingmaybeaneffectivewaytotreatrabbitfemoralheadnecrosis.　　Keywords：femoralheadnecrosis；animalmodel;bonemarrowstromalcell；cellculture;transplantation

　　近年来一些研究发现骨髓基质干细胞（bonemarrowstromalcell，BMSC）减少与股骨头缺血性坏死有密切关系。有报道用自体红骨髓移植治疗股骨头缺血性坏死取得了较好的疗效。认为移植于股骨头内BMSC的数目决定着治疗的成败。本实验用移植体外增殖的BMSC治疗兔股骨头缺血性坏死，探讨BMSC在早期股骨头缺血性坏死治疗中的作用及修复机理，为临床提供理论依据和合理的治疗方法。　　1材料与方法　　1.1动物分组　　成年新西兰大白兔24只，雌雄不限，年龄4～5个月，体重2.5～3.5kg。由白求恩国际和平医院动物实验室提供。随机分为A、B2组，每组12只。A组为髓芯减压组，B组为细胞移植组。　　1.2主要试剂　　地塞米松磷酸钠注射液，浙江仙琚制药股份有限公司，国药准字：H330220827，批号：041105。DMEM细胞培养液，GIBCO公司。胎牛血清，杭州四季青公司。　　1.3BMSC的获取和培养　　从实验动物髂后上嵴处抽取骨髓。全骨髓培养。用硬膜外穿刺针刺入髂骨1～1.5mm，以含有100μ／ml肝素0.2ml的5ml注射器，迅速抽取骨髓2ml，所获骨髓种植于6孔细胞培养板内，每孔种植1ml，每只实验动物种植2个孔。加入含20%胎牛血清DMEM液5ml，反复吹打，再加入地塞米松10-8mmol／L，微型震荡器上震荡2min，然后放入细胞培养箱内培养。培养箱温度37℃，含5%CO2，100%饱和湿度。5d后换液，冲去红细胞，可见多个成纤维细胞克隆贴壁生长。待细胞长满培养孔面积一半时，用0.25%胰蛋白酶消化，原孔传代，2～3d可见细胞长满培养孔，将其按1×106／cm2密度传入细胞培养瓶内。待第3代细胞长满后，消化细胞并将细胞配成2×106／ml细胞悬液，复合于3cm×4cm的明胶海绵上。每块明胶海绵含细胞悬液50μl，共10万个细胞，在细胞培养箱中孵育4h备用。　　1.4动物造模及细胞移植　　所有动物双侧股骨头均参加实验。取俯卧位。硫贲妥钠40mg/kg腹腔麻醉。后侧入路，暴露股骨头后不脱位。用液氮棉球连续冷冻3min。自然复温后，用直径为3.5mm钻头从股骨颈内后侧向股骨头内钻入4mm，到达关节软骨下。A组钻孔后，植入明胶海绵。B组钻孔后，植入复合有自体BMSC的明胶海绵，关闭伤口。术后连续3d臀大肌注入硫酸庆大霉素注射液，2ml／只，每日1次。两组各于术后2、4、6、8周各处死3只动物，作大体观察、X线检查和组织学观察。　　2结果　　2.1BMSC的生长观察及鉴定　　骨髓培养到第5d，冲去表面红细胞，可见每个孔内有3～7个成纤维细胞样克隆集落贴壁生长，呈放射状，直径大小不等。单个细胞呈长梭形，胞浆丰富，细胞核居中，换液2～3d后细胞克隆增大，待细胞生长占满培养孔一半时，消化传代。消化传代后细胞首先呈圆形透亮，2～4h后贴壁生长变成短梭形，2～3d后细胞长满培养瓶底，呈长梭形紧密排列。3代细胞接种后2～7d呈指数生长，倍增时间为48h。　　2.2动物的一般观察　　术后1周内，动物双侧后肢轻度跛行，运动减少，采食减少。而后采食增加，运动增多，步态转好。2周后恢复术前状态，伤口Ⅰ期愈合。　　2.3股骨头标本大体观察　　术后2周标本，A、B2组股骨头外形均圆，关节软骨呈苍白色，A组有1个标本关节软骨面有少许剥脱。4周标本，两组股骨头外形均圆，关节软骨呈苍白色，所有关节软骨轻度剥脱。6周时，除A组有1个股骨头标本轻度塌陷外，两组其余股骨头标本外形均圆，软骨呈苍白色，关节软骨剥脱加重。8周股骨头标本，两组股骨头外形均圆，关节软骨剥脱比6周时加重，部分关节软骨下骨轻度暴露，软骨呈苍白色。　　2.4X线观察　　A、B2组标本在钻孔缺损区以外的变化大致相似，术后2周，两组股骨头密度有所增加，4周标本，除股骨头密度略比2周时增高外，其余无明显变化，6周标本，骨小梁结构出现紊乱，软骨下囊性变，8周标本，股骨头密度高，骨小梁结构紊乱加重，软骨下囊性变明显。两组标本在钻孔缺损内有着不同的变化，术后2周时，2组钻孔缺损区密度低，4周标本，A组钻孔缺损区中心密度低，边缘密度有所增高，B组整个钻孔缺损区密度增高。6周标本，A组仍呈现钻孔缺损区中心低密度，边缘高密度，B组钻孔缺损区出现骨小梁结构。8周标本，A组钻孔缺损区中心密度低，边缘密度增高，形成硬化线，B组钻孔缺损区有正常骨小梁结构。