儿童系统性红斑狼疮与类风湿性关节炎患者血细胞黏附能力与红细胞CD35分子比较研究

时间 : 2009-11-28 00:45:58 来源：journal.shouxi.net

[摘要]

　　目的：研究儿童患者中类风湿性关节炎（rheumatoid arthritis, RA）和系统性红斑狼疮（systemic lulups erythematosus，SLE）血细胞的天然免疫功能状况，比较在儿童患者中这两种疾病红细胞表面CD35定量活性变化，

儿童系统性红斑狼疮与类风湿性关节炎患者血细胞黏附能力与红细胞CD35分子比较研究首席医学网2008年11月04日17:04:00Tuesday中华临床医师杂志征稿内科临床新进展研讨班重症与血流动力学大会血液净化技术学习班医学类核心期刊征稿第六届世界中医药大会2009世界高血压大会第四届中国国际白血病急危重病护理交流会国际超声造影研讨会2009年中国药学大会医学影像学术交流会结直肠肛门外科会议口腔正畸学术会议征稿广东研究生学术论坛

作者：司马贯忠作者单位：深圳市宝安区西乡人民医院，广东深圳518102

加入收藏夹

【摘要】　　目的：研究儿童患者中类风湿性关节炎（rheumatoidarthritis,RA）和系统性红斑狼疮（systemiclulupserythematosus，SLE）血细胞的天然免疫功能状况，比较在儿童患者中这两种疾病红细胞表面CD35定量活性变化，探讨两种疾病的发病机制。方法：分离新鲜红细胞、淋巴细胞、粒细胞三系，分别测定其对肿瘤细胞的快速天然免疫黏附反应。应用流式细胞仪测定红细胞表面CD35的表达水平。结果：RA儿童患者红细胞、淋巴细胞以及粒细胞对肿瘤细胞黏附率均明显高于正常对照组（P<0.001）；SLE儿童患者血细胞对肿瘤细胞黏附率又明显低于正常对照组（P<0.001）；RA儿童患者的血细胞对肿瘤细胞黏附率，进展期最高，静止期其次，消退期再次，RA儿童患者各期均明显高于正常对照组（P<0.05）。RA儿童患者红细胞CD35明显高于正常对照组和SLE患者组（P<0.001）；而SLE儿童患者CD35明显低于正常对照组（P<0.001）；类风湿性关节炎红细胞CD35分子与红细胞黏附率呈显著正相关（γ=0.804,P<0.05）。结论：儿童SLE和RA患者红细胞天然免疫功能存在紊乱，并可能与病情的活动性有关。红细胞免疫功能检测可作为判定儿童患者RA与SLE病情演变及预后的指标之一。

【关键词】儿童类风湿性关节炎系统性红斑狼疮红细胞黏附率CD35

　　ComparativeStudyofFreshBloodCellNatureImmuneReactionofChildrenPatientswithSLEandPatientswithRA

　　SIMAGuanzhong

　　（XixiangPeople’sHospitalinBao’anDistrict,Shenzhen,Guangdong518102,China）　　Abstract:ObjectiveToresearchtheerythrocytesofconditionofinnateimmunityinthechildrenpatientswithRAandSLE,comparingwithchangesofactivityofCD35（CR1）ontheerythrocytebetweenthesetwodiseases,andfurtherdiscussthepathogenesisofthesetwodiseases.MethodsMeasurereactionofinnateimmunityoferythrocytes,lymphocytesandneutrophilsisolatedfromfreshbloodofpatientswithRAandSLE,andthenmeasurethelevelofexpressionofCD35byusingflowcytometry（FCM）.ResultsRosetterateoferythrocyte，lymphocytesandgranulocytesadheringtocancercellinthepatientswithRAwerehigherthancounterpartsofnormalcontrols（P<0.001）respectively；rosetterateoferythrocyte，lymphocytesandgranulocytesadheringtotumorcellsinthepatientswithSLEwerelowerthancounterpartsofnormalcontrols（P<0.001）respectively.TherosetterateofthesetotumorcellsofpatientswithRA,showedthehighestfigurechangedduringdifferentstages,includingdevelopingperiod>quiescentperiod>extinctionperiod.Andtherosetteratesinthesethreegroupsweresignificantlyhigherthanonesofthatinnormalcontrols.TheexpressionofCD35ontheerythrocyteofpatientswithRAwassignificantlyhigherthanthatofnormalcontrols（P<0.001）,whilethatofpatientswithSLEwassignificantlylowerthanthatofnormalcontrols（P<0.001）.TheCD35ontheredcellsshowedsignificantlypositivecorrelation（γ=0.702,P<0.01）withadheringerythrocytesandpositivelycorrelationwiththerateoflymphocytes（P<0.05）.ConclusionThenativeimmunefunctionofpatientswithSLEorRAwasoutofbalance,andperhapsitschangeshavearelationwithactivityofdiseases.ItwassuggestedthattheerythrocyteimmunityfunctionseemstobeanewindicatortotheconditionofpatientswithRAorSLEtojudgethedevelopmentandprognosis.　　Keywords：Children;Rheumatoidarthritis；Systemiclupuserythematosus；erythrocyte；rosetterate；CD35

　　类风湿性关节炎（rheumatoidarthritis,RA）是儿童患者中常见的全身性自身免疫性疾病，主要侵犯关节滑膜，心、肺、肾、动脉、神经及眼等脏器也可受累，严重影响儿童患者的生活质量。系统性红斑狼疮（Systemiclupuserythematosus,SLE）是一种累及全身多系统的自身免疫性疾病，本病与机体免疫调节失常有关。RA与SLE均为自身免疫性疾病，但发病机制尚不清楚。1989年我国学者首次发现了血细胞在补体系统帮助下可以共同免疫黏附多种肿瘤细胞，出现快速天然免疫反应的现象［1］，主要原理为在血细胞（包括红细胞、B淋巴细胞、某些T淋巴细胞、粒细胞、血小板等）中包含有CD35（CR1），当癌细胞进入血循环中，首先可旁路激活补体系统黏附C3b，进而被血细胞所识别（特别是红细胞CD35），免疫黏附和包绕癌细胞［2］。本文通过对RA和SLE儿童患者天然血细胞（红细胞、淋巴细胞、粒细胞）免疫黏附能力的测定及RA儿童患者红细胞表面CD35分子的表达水平的检测,以期通过对RA和SLE儿童患者的天然免疫反应功能状况的比较，进一步探讨这两种疾病的发病机制。

　　1材料与方法

　　1.1主要试验试剂与仪器癌细胞为上海新华医院免疫室保存；离心机（上海医用分析仪器厂）；热恒温水温箱（上海医疗器械五厂）；生物显微镜（日本OLYMPUS公司）；美国BDFacscan型流式细胞仪；鼠抗人CR1（CD35）单克隆抗体（上海晶美公司）。

　　1.2检测对象54例RA儿童患者均为我院门诊及住院患者，男29例,女25例；年龄5岁～15岁，平均年龄10岁，平均病期2.34a（49d～6a）。SLE组38例，年龄6岁～15岁，平均年龄11岁，男10例，女28例，平均病期2.56a（38d～7a），其中活动期21例，稳定期17例，均为我院门诊及住院患者。所有病例均不伴有其他急慢性疾病。正常对照组儿童42例，男16例，女28例；年龄6岁～16岁，平均年龄12岁，均为健康献血员。

　　1.3方法

　　1.3.1血细胞制备取枸橼酸钠新鲜血2ml，淋巴细胞分离液分离淋巴细胞和粒细胞。淋巴细胞常规分离后用生理盐水洗涤1次，备用；在冰水下快速将粒细胞中的红细胞破坏，并去除红细胞膜部分备用；取分离淋巴细胞剩余的红细胞5μl，置于400μl的生理盐水中，配置成悬液备用。如淋巴细胞和粒细胞中还有红细胞需再破坏1次。

　　1.3.2红细胞自然免疫黏附肿瘤细胞的测定取1×108/ml红细胞悬液50μl置入一编号试管，加入枸橼酸钠抗凝自身血浆50μl和1×106/ml癌细胞100μl。充分混匀，37℃水浴30min。加生理盐水100μl和0.25%戊二醛50μl。轻轻旋转混匀，固定5min后，取150μl加瑞氏染液30μl染色，40×16显微镜下阅片。癌细胞染成紫红色，癌细胞结上3个或3个以上红细胞为一花环，均衡计数100个肿瘤细胞，计出花环率。

　　1.3.3淋巴细胞自然免疫黏附肿瘤细胞的测定取1×107/ml淋巴细胞悬液50μl、枸橼酸钠抗凝自身血浆50μl和1×106/ml肿瘤细胞100μl混匀，37℃水浴30min。加生理盐水100μl和0.25%戊二醛50μl。轻轻旋转混匀，固定5min后，取150μl加瑞氏染液染色，40×16显微镜下阅片。瘤细胞染成紫红色，淋巴细胞染成深蓝色。肿瘤细胞结上2个以上淋巴细胞为一花环，均衡计数100个肿瘤细胞，计出花环率。

　　1.3.4粒细胞自然免疫黏附肿瘤细胞测定取1×107/ml粒细胞悬液50μl、枸橼酸钠抗凝自身血浆50μl和肿瘤细胞100μl混匀，37℃，30min。加生理盐水100μl和0.25%戊二醛50μl。轻轻旋转混匀，固定5min后，取150μl加瑞氏染液30μl染色，40×16显微镜下阅片。肿瘤细胞染成紫红色，粒细胞染成深蓝色。肿瘤细胞结上2个以上粒细胞为一花环，均衡计数100个肿瘤细胞，计出花环率。

　　1.3.5红细胞CD35定量测定在编号试管中分别加入PBS液50μl，鼠抗人CR1（CD35）单克隆抗体1.5μl，待测枸橼酸钠抗凝新鲜血0.5μl，充分混匀，室温下避光30min。加入PBS液2ml，混匀，1500r/min离心5min。弃去上清液后加入羊抗鼠IgGFITC1μl，充分混匀，室温下避光30min。再加入PBS液2ml，混匀清洗，1500r/min离心5min。弃去上清液后加入PBS300μl，混匀后上流式细胞仪测试红细胞平均荧光强度。

　　1.3.6统计学处理各组间采用样本均数差别t检验。以直线相关法分析每组T细胞间关系，并作相关系数t检验。

　　2.1RA、SLE儿童患者和正常儿童的红细胞、淋巴细胞及粒细胞对肿瘤细胞黏附率RA儿童患者红细胞、淋巴细胞及粒细胞对肿瘤细胞黏附率明显高于正常儿童（P<0.001）和SLE患者（P<0.001），SLE儿童患者血细胞对肿瘤细胞黏附率又明显低于正常对照组（P<0.001）（见表1）。RA儿童患者进展期其血细胞对肿瘤细胞黏附率，明显高于静止期（P<0.001），静止期又明显高于消退期（P<0.001），RA儿童患者消退期亦明显高于正常对照组（P<0.00）（见表2）。RA儿童患者红细胞CD35分子定量均明显高于正常对照组和SLE儿童患者组（P<0.001）；而SLE儿童患者CD35分子定量均明显低于正常对照组（P<0.001）（见表3）。

　　表1RA患者、SLE儿童患者与正常儿童三系血细胞天然免疫黏附率检测结果比较（略）

　　注：与正常对照组比较*P<0.001。

　　表2RA儿童患者各期血细胞对肿瘤细胞天然免疫黏附率检测结果比较（略）

　　注：与消退期组比较，△P<0.001；与静止期组比较，#P<0.001；与正常对照组比较，*P<0.001。

　　2.2各组儿童红细胞CD35分子与红细胞对肿瘤细胞的黏附率比较RA儿童患者红细胞CD35分子与红细胞对肿瘤黏附率呈显著正相关（γ=0.746,P<0.001）。正常对照组（γ=0.021,P>0.05）与SLE（γ=0.138,P>0.05）儿童患者红细胞CD35与红细胞对肿瘤细胞的黏附率无相关性。

　　2.3RA儿童患者、SLE儿童患者和正常儿童红细胞天然免疫分子CD35结果比较RA儿童患者CD35与淋巴细胞对肿瘤细胞黏附率呈正相关（P<0.05）,CD35与粒细胞对肿瘤细胞黏附率无明显相关性（P>0.05）；正常对照组CD35与血细胞对肿瘤的黏附率无明显相关性。SLE儿童患者组CD35分子与淋巴细胞无明显负相关（P<0.05），CD35与粒细胞无相关性（P>0.05）（见表3）。

　　表3RA儿童患者、SLE儿童患者和正常儿童红细胞天然免疫分子CD35结果比较与相关系数（r）比较（略）

　　注:与正常对照组比较*P<0.001。

　　3讨论　　RA和SLE均为自身免疫性疾病，发病机制不明。一般认为，免疫系统失衡与紊乱是多数自身免疫性病发病的主要原因之一。红细胞可黏附多种肿瘤细胞［1］，且红细胞和白细胞可共同黏附各种肿瘤细胞［3］；红细胞黏附肿瘤细胞的能力与红细胞CD35密度相关基因多态性密切相关［4］；红细胞I型补体受体（ECR1，CD35）介导红细胞结合补体调理免疫复合物，协助防御对抗循环免疫复合物（IC）的沉积［5］。SLE患者红细胞膜上结合IC的位点减少，随后的研究确定了原因在于CD35（CR1）的表达减少，并发现红细胞CD35的下降与SLE的活动性呈显著相关［1］。国外有研究指出，SLE、获得性免疫缺陷综合征（AIDS）、胰岛素依赖型糖尿病、疟疾等红细胞CD35（CR1）水平下降，CD35功能可能受损［6，7，8］。在一些特殊的自身免疫性疾病和慢性感染中，红细胞CD35获取的丢失，可能是因为自身抗体对抗CD35（CR1）的活性所致［9］。有研究发现，淋巴细胞和粒细胞上的补体受体，也可以与补体激活致敏的肿瘤细胞相结合［10，11］。SLE儿童患者红细胞免疫功能低下，红细胞C3b受体花环（RBCC3b）率明显低于正常人群，红细胞免疫复合物花环（RBCIC）率明显高于正常人群［12，13］。少数SLE儿童患者RBCC3b花环率及RBCIC花环率均下降，属原发性红细胞免疫功能低下。通过ELISA、流式细胞仪等方法对红细胞CD35（CR1）分子定量测定显示SLE患者CD35数量明显减少，活性明显下降［14，15］。　　本研究则进一步证实了SLE儿童患者血细胞（红细胞、淋巴细胞、粒细胞）天然黏附率和CD35分子与正常儿童对照显著减少，据此分析可能是由于CR1（CD35）分子在CIC清除过程中的消耗，或CD35（CR1）分子被CIC封闭都可致CD35（CR1）分子数量下降；在这一点上，我们的结果与推论与国外的研究结果相似［16］。　　Nielsen等发现SLE患者红细胞上CD35的下降使红细胞对IC的缓冲能力显著下降［10］。IC激活后的中性粒细胞诱导内皮细胞通透性增强，有学者发现这种作用可以被红细胞上CD35所抑制并能被CD35单抗所增强，提示红细胞CR1的下降很可能是促使中性粒细胞诱发内皮细胞通透性增加，继而引起组织损伤的重要因素［17，18］。SLE患者红细胞黏附活性还与血清中抑制因子（RFIR）活性上升及促进因子（RFER）活性下降有关。CD35分子数量与其黏附CIC的功能呈显著正相关［19，20，21］，证明细胞间的黏附率下降，CD59参与T细胞黏附及活化，抗CD59单抗对T细胞的活化有明显的抑制作用，自身红细胞与T细胞可形成花结［3］。通过PCR加HindⅢ酶切技术测定患者红细胞CR1（CD35）密度相关基因多态性，证明SLE患者红细胞CR1（CD35）基因型密度多态性分布略有不同，但差异不显著，并发现活动期SLE患者红细胞CR1基因HH百分率明显低于正常人群，红细胞CR1基因组HH型SLE患者预后比HL型患者好，而HL型比LL型好［22］，因此临床同时测定SLE患者红细胞CR1基因组型别和红细胞CR1活性对病情转归、疗效、预后判断有辅助价值［23，24，25］。　　RA发病机制不清，但免疫异常显然是重要的因素，提示该病有免疫功能紊乱。本研究进一步测定CD35RA患者血细胞天然免疫反应能力增加，尤其表现在RA的进展期和静止期，血细胞免疫黏附肿瘤花环明显增高（P<0.001），红细胞CD35分子高表达并与红细胞对肿瘤细胞的黏附率明显正相关（r=0.806），说明这两种分子有协同促细胞间的黏附作用，提示红细胞高表达CD35可能也是RA发病机制中促进T细胞活化、增殖的重要途径；在RA的免疫发病机制中，红细胞免疫系统可能与白细胞免疫系统相互协调。这也可能与病情的严重程度有关。　　综上所述，红细胞CD35分子在临床发病机制中起到一定的作用，但是SLE和RA的发病机制十分复杂，不能孤立的看待某一种分子的异常。因此，随着SLE和RA研究的不断深入，红细胞是否可以作为这检测这两种疾病病情好转与严重指标，更好地指导临床治疗，其原理有待进一步研究，并有助于阐明这两种疾病的发病机制。

【参考文献】　　［1］郭峰，黄盛东，郝丽，等.红细胞在肿瘤免疫反应中的作用［J］.中华微生物和免疫学杂志，1995，15（3）：183.　　［2］郭峰．肿瘤红细胞免疫研究［M］.济南：济南出版社，1997：24.　　［3］郭峰，钱宝华，闵翠荷.血液免疫学研究［M］.上海：上海第二军医大学出版社，1998：19.　　［4］郭峰，张俊洁，赵书平，等.肿瘤患者红细胞CR1基因组密度多态性变化［J］.中华微生物学和免疫学杂志，1998，18（4）：1.　　［5］BirminghamDJ，ChenW,LiangG,etal.ACR1polymorphismassociatedwithconstitutiveerythrocyteCR1levelsaffectsbindingtoC4bbutnotC3b［J］.Immunology，2003，108（4）:531538.　　［6］CockburnIA,DonvitoB,CohenJH,etal.Asimplemethodforaccuratequantificationofcomplementreceptor1onerythrocytespreservedbyfixingorfreezing［J］.JImmunolMethods，2002，271（12）:5964.　　［7］NuutilaJ,HohenthalU,LaitinenI,etal.Quantitativeanalysisofcomplementreceptors,CR1（CD35）andCR3（CD11b）,onneutrophilsimprovesdistinctionbetweenbacterialandviralinfectionsinfebrilepatients:comparisonwithstandardclinicallaboratorydata［J］.JImmunolMethods，2006，315（12）:191201.　　［8］BirminghamDJ,GavitKF,McCartySM,etal.ConsumptionoferythrocyteCR1（CD35）isassociatedwithprotectionagainstsystemiclupuserythematosusrenalflare［J］.ClinExpImmunol，2006，143（2）:27480.　　［9］SadallahS,HessC,TrendelenburgM,etal.Autoantibodiesagainstcomplementreceptor1（CD35）inSLE,livercirrhosisandHIVinfectedpatients［J］.ClinExpImmunol，2003，131（1）:174181.　　［10］NielsenCH,MatthiesenSH,LyngI,etal.Theroleofcomplementreceptortype1（CR1,CD35）indeterminingthecellulardistributionofopsonizedimmunecomplexesbetweenwholebloodcells:kineticanalysisofthebufferingcapacityoferythrocytes［J］.Immunology，1997，90（1）:12911．　　［11］CotterMJ,ZaissAK,MuruveDA.NeutrophilsinteractwithadenovirusvectorsviaFcreceptorsandcomplementreceptor1［J］.JVirol，2005，79（23）:1462214631.　　［12］RossGD,YountWJ,WalportMJ,etal.Dieasesassociatedlossoferythrocytecomplementreceptor（CD35,CR1）inpatientswithsystemiclupuserythematosusandotherdiseasesinvolvingautoantibodiesand/orcomplementactivation［J］.JImmunol,1985,135（9）:20022014.　　［13］BoackleSA,CulhaneKK,BrownJM,etal.CR1/CR2deficiencyaltersIgG3autoantibodyproductionandIgAglomerulardepositionintheMRL/lprmodelofSLE［J］.Autoimmunity，2004，37（2）:11123.　　［14］JonesDRE,ThompsonS,AmirchettyS,elal.Anenzymetindedimmunosorbentassayforcomplementregulatoryproteinsandmembnraneboundimmunoglobulinsonintactredbloodcells［J］.JImmunolMethods,1994,177:235.　　［15］CohenH,LutzJ,PennaforteL,elal.PeripheralcatabolismofCR1onerythrocytesfromhealthyindividualswithsystemiclupuperythematosus（SLE）［J］.ClinExpImmunol,1992,87（3）:422427.　　［16］GibsonN,WaxmanF.Relationshipbetweenimmunecomplexbindingandreleaseandthequantitativeexpressionofthecomplementreceptor,Type1（CR1,CD35）onhumanerythrocyte［J］.ClinImmunolImmunopathol,1994,70（2）:104113.　　［17］BeynonHL,DaviesKA,HaskardDO,etal.Erythrocytecomplementreceptortype1andinteractionsbetweenimmunecomplexes,neutrophils,andendothelium［J］.JImmunol,1994,153（7）:31603167.　　［18］SivasankarB,DindaAK,TiwariSC,etal.ModulationofurinaryCR1insystemiclupuserythematosus［J］.Lupus，2004，13（4）:22833.　　［19］RafnarB,TraustadottirK,SigfussonA,etal.Anenzymebasedassayforthemeasurementofcomplementmediatedbindingofimmunecomplexstoredbloodcells［J］.JImmunolMethods,1998,211（1）:171181.　　［20］SivasankarB,DindaAK,TiwariSC,etal.ModulationofurinaryCR1insystemiclupuserythematosus［J］.Lupus，2004，13（4）:22833.　　［21］HepburnAL,MasonJC,DaviesKA.ExpressionofFcgammaandcomplementreceptorsonperipheralbloodmonocytesinsystemiclupuserythematosusandrheumatoidarthritis［J］.Rheumatology（Oxford），2004，43（5）:547554.　　［22］DarbonneWC,RiceGC,MohlerMA,etal.Redbloodcellsareasinkforinterleukin8,aleukocytechemotaxin［J］.JClinInvest,1991,88（4）:13621369.　　［23］ErdeiA,PrechlJ,IsaakA,etal.RegulationofBcellactivationbycomplementreceptorsCD21andCD35［J］.CurrPharmDes，2003，9（23）:18491860.　　［24］SolomonS,KolbC,MohantyS.Transmissionofantibodyinducedarthritisisindependentofcomplementcomponent4（C4）andthecomplementreceptors1and2（CD21/35）［J］.EurJImmunol，2002，32（3）:644651.　　［25］DrejaH,AnnenkovA,ChernajovskyY.Solublecomplementreceptor1（CD35）deliveredbyretrovirallyinfectedsyngeneiccellsorbynakedDNAinjectionpreventstheprogressionofcollageninducedarthritis［J］.ArthritisRheum，2000，43（8）:16981709.

请您在下面输入常用的Email地址、职业以便我们定期通过邮箱发送给您最新的相关医学信息，感谢您浏览首席医学网！

邮箱：职业：