广东地区土壤中分离的棘阿米巴CG/S1株的18S rDNA基因分析

时间 : 2009-11-26 13:52:03 来源：journal.shouxi.net

[摘要]

从广东地区土壤中分离棘阿米巴CG/S1株，测定其18S rDNA基因序列.［方法］从土壤中分离棘阿米巴CG/S1株，提取基因组18S rDNA，应用棘阿米巴属特异性引物进行PCR扩增，测定序列，用分子生物学软件Clustal X进行序列分

广东地区土壤中分离的棘阿米巴CG/S1株的18SrDNA基因分析首席医学网2007年12月27日17:12:27Thursday中华临床医师杂志征稿内科临床新进展研讨班重症与血流动力学大会血液净化技术学习班医学类核心期刊征稿第六届世界中医药大会2009世界高血压大会第四届中国国际白血病急危重病护理交流会IOF亚洲骨质疏松班2009年中国药学大会医学影像学术交流会结直肠肛门外科会议口腔正畸学术会议征稿广东研究生学术论坛

作者：王月华作者单位：吉林医药学院病原生物学教研室，吉林吉林132013

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【摘要】从广东地区土壤中分离棘阿米巴CG/S1株，测定其18SrDNA基因序列.［方法］从土壤中分离棘阿米巴CG/S1株，提取基因组18SrDNA，应用棘阿米巴属特异性引物进行PCR扩增，测定序列，用分子生物学软件ClustalX进行序列分析，并与其他棘阿米巴分离株进行比较分析.［结果］棘阿米巴CG/S1的18SrDNA全基因序列为2292bp，基因型为T5型；CG/S1与A.lenticulata7327株的序列差异率为0.61%，与CB/S1株的序列差异率为0.74%.［结论］广东地区土壤中分离的棘阿米巴Acanthamoebasp.CG/S1为A.lenticulata株.

【关键词】基因型序列分析棘阿米巴属

Analysisof18SrDNAgeneofAcanthamoebasp.CG/S1isolatedfromGuangdongsoil

WANGYuehua1，XUANYinghua2，ZHENGShanzi2*，CUIChunquan2

（1.DepartmentofPathogenicBiology,JilinMedicalCollege，Jilin132013,Jilin,China;2.DepartmentofPathogenicBiologyandImmunology,YanbianUniversityCollegeofBasicMedicine，Yanji133000，Jilin，China）

ABSTRACT:OBJECTIVEToanalyzethe18SrDNAgenotypeofAcanthamoebasp.CG/S1strainsisolatedfromtheGuangdongsoil.METHODSThestrainsofAcanthamoebasp.CG/S1wereisolatedfromsoiloftheGuangdong.Full18SrDNAgenesequencesofCG/S1wereextracted,amplifiedbyusingPCRandcloned,thenPCRproductsweresequenced.Thecompletesequencesof18SrDNAwereanalyzedbysoftwareClustalXandusedforphylogeneticanalysis.RESULTSThefulllengthofCG/S1was2292bpandthegenotypewasT5.CONCLUSIONAcanthamoebasp.CG/S1strainsisolatedfromtheGuangdongsoilisA.lenticulatastrains.

Keywords:genotype；sequenceanalysis;acanthamoeba

棘阿米巴是（Acanthamoebasp.）广泛存在于土壤、水及腐败物等自然环境中的致病性自由生活阿米巴，是棘阿米巴性角膜炎（acanhtamoebakeratitis，AK）和肉芽肿性阿米巴性脑炎（granulomatousamoebicencephalitis，GAE）的病原体.Jones等［1］报道了首例由棘阿米巴引起的眼部感染，而随着角膜接触镜的广泛应用，AK的发病率显著升高.目前，多数学者采用分子生物学方法对棘阿米巴进行分类及致病性研究［2，3］.本实验对广东地区土壤中分离出的棘阿米巴CG/S1株进行了18SrDNA基因序列分析，探讨了该地区土壤中棘阿米巴虫株的基因特点，旨在为它的分子生物学特点及其致病性研究奠定基础.

1材料与方法

1.1棘阿米巴的分离和培养参照文献［4］的方法从土壤中分离、培养和纯化棘阿米巴，DNA的提取及PCR扩增按照文献［5］的方法进行.取棘阿米巴培养液50mL，离心，用PBS洗涤3次，用常规酚／氯仿法提取基因组DNA.PCR扩增引物为5′CCGAATTCGTCGACAACCTGGTTGATCCTGCCAGT3′和5′GGATCCAAGCTTGATCCTTCTGCAGGTTCACCTAC3′.PCR参数为94℃　3min，94℃　1min，60℃　1min，72℃　2.5min，共30个循环，72℃延伸10min.将PCR扩增产物用琼脂电泳分离,用pGEMTeasySystem连接,转入至E.coli培养.选出阳性克隆，用WizardPlusy试剂盒提取质粒DNA,用EcoR1酶切并电泳确认目的DNA.

1.218SrDNA基因型分析将PCR扩增产物送至韩国Macrogen公司进行序列测定，用ClustalX软件与其他分离株和基因库中已知的T1～T12基因进行序列匹配排列分析,构建进化树状系列图［5］.

2.1PCR结果应用棘阿米巴属特异性引物，对PCR扩增产物行琼脂糖电泳分离结果为2.3kbp的条带（图1A）.提取质粒DNA,EcoR1消化，电泳分离结果分别为2.3、3.0kbp的2条条带（图1B），其中前者为目的基因，后者为载体.

　　2.218SrDNA基因序列测定CG/S1株的18SrDNA基因全长为2292bp.BLAST结果示，CG/S1株基因序列最接近于A.lenticulatastrain7327，与基因库中的A.lenticulata　12个虫株均有99%的一致性.用ClustalX软件进行序列分析结果示，CG/S1与A.lenticulata7327株序列差异率为0.61%，与CB/S1株序列差异率为0.74%.

2.3建立进化树状图根据序列比较分析，利用ClustalX软件的TreeView对CG/S1株与T1～T12型和其他棘阿米巴株枝的株构建进化树状系列图，进行棘阿米巴虫株聚类分析（图2）.

自由生活的阿米巴种类较多，其中棘阿米巴为致病性的自由生活阿米巴，可引起免疫功能低下人群发生亚急性或慢性中枢神经系统感染，还可引起感染性角膜疾病.研究结果表明，可引起人体感染的棘阿米巴属于特定的形态和基因类型，致病性棘阿米巴形态上多属于第二类群，但棘阿米巴形态受实验条件的影响.致病性棘阿米巴的基因型多为T4型，其次为T3型，少数为T2,T5,T6,T11型［6～9］.Stothard等［3］报道，棘阿米巴的18SrDNA全基因序列长度为2300～2700bp，且同一个T2型之间的最大序列差异率为4.9%，而T4型为4.4%，不同基因型的差异率至少为5.0%.本实验结果示，广东地区土壤中分离出的棘阿米巴虫株CG/S1的18SrDNA全基因序列为2292bp，与基因库中A.lenticulata12虫株及从土壤中分离出的KA/MSG12株具有99%的相同基因序列.CG/S1，T1～T12型，国内土壤分离株CJY/S1和CJY/S2的棘阿米巴虫株聚类分析结果表明，CG/S1株属18SrDNA基因型的T5型与A.lenticulata682株的亲缘关系最近.

【参考文献】［1］JonesDB，VisvesvaraGS，RobinsonNM.AcanthamoebapolyphagakeratitsandAcanthamoebauveitisassociatedwithfatalmeningoencephalitis［J］.TransOphthalmolSocUK，1975，95：221.［2］GastRJ，LedeeDR，FuerstPA，　etal..SubgenussystematicsofAcanthamoeba:Fournuclear18SrDNAsequencetypes［J］.JUEukMicobiol，1996，43：498.［3］StothardDR，SchroedrDiedrichJM，AwwadMH，etal..TheevolutionaryhistoryofthegenusAcanthamoebaandtheeightnew18SrRNAgenesequencetype［J］.JEukMicrobiol，1998，45：45.［4］郑善子，申成华，王铁，等.棘阿米巴的分离及实验室培养［J］.延边大学医学学报，2003，26（3）：164.［5］郑善子，玄英花，王月华.棘阿米巴的分离土壤分离株CB/S1的18SrDNA基因型鉴定［J］.中国人兽共患病杂志，2006，22（11）：1039.［6］ZhangXS，WangZQ，LiR，etal..Identificationof18SRibosomalDNAgenotypeofAcanhtamoebafronpatientswithkrtatitisinNorthChina［J］.InvestigativeOphthalmologyandVisalScience，2004，45：1904.［7］MaghsoodAH，SissonsJ，RezaianM，etal..AcanthamoebagenotypeT4fromtheUKandIranandisolationoftheT2genotypefromclinicalisolates［J］.JMedMicrobiol，2005，54（8）：755.［8］SpanakosG，TzanetouK，MiltsakakisD，etal..GenotypingofpathogenicAcanthamoebaeisolatedfromclinicalsamplesinGreeceReportofaclinicalisolatepresentingT5genotype［J］.ParasitolInt，2006，17（2）.［9］SealDV.Acanthamoebakeratitisupdateincidence,molecularepidemiologyandnewdrugsfortreatment［J］.Eye，2003，17（8）：893.

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